吳 倩魏志平劉彥群陳丹萍

貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡及周期的影響

吳 倩1魏志平2?劉彥群2陳丹萍3

目的: 評(píng)價(jià)貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響。方法: 體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，不同濃度貝伐珠單抗分別作用HaCaT細(xì)胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色法觀察貝伐珠單抗誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)貝伐珠單抗HaCaT細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果: 貝伐珠單抗處理HaCaT細(xì)胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色顯示細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、核裂解；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡增加，G0/G1期細(xì)胞的比例增加。結(jié)論: 貝伐珠單抗可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡，同時(shí)可有效阻滯HaCaT細(xì)胞的周期進(jìn)程，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期。

HaCaT細(xì)胞； 貝伐珠單抗； 凋亡； 細(xì)胞周期

貝伐珠單抗(Bevacizumab)又叫安維汀(Avastin)、阿瓦斯丁，是重組的人源化IgG1單克隆抗體，靶向作用于腫瘤賴以生存的血管，通過(guò)抑制腫瘤血管生成，達(dá)到阻止腫瘤生長(zhǎng)的目的。體內(nèi)、外研究證實(shí)貝伐珠單抗能與VEGF結(jié)合，阻止其與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而阻斷其生物活性發(fā)揮抗血管增生作用。貝伐珠單抗目前在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于以聯(lián)合5－氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案，一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。在一些以血管增生為基礎(chǔ)的疾病，如視網(wǎng)膜血管增生等疾病的治療中也進(jìn)行了臨床研究并取得良好效果。1近年的研究表明靶向作用于銀屑病病理性血管生成可明顯改善銀屑病免疫學(xué)和表皮的變化，且在臨床治療中也觀察到應(yīng)用貝伐珠單抗治療癌癥的同時(shí)患者的銀屑病癥狀可得到明顯改善。2但貝伐珠單抗對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)以HaCaT細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞模型，研究貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡及其周期的影響，為其治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，試圖為銀屑病的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試驗(yàn)藥物 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞)購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。貝伐珠單抗，規(guī)格100 mg/4 m L，購(gòu)于Roche公司。

1.2 試劑 RPMI 1640購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst 33258染色液購(gòu)于Beyotime公司；Annexin V－FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京寶賽生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期PI染液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HaCaT細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。HaCaT細(xì)胞分組處理如下:I組:對(duì)照組，只加RPMI 1640培養(yǎng)液；II組:50μg/mL貝伐珠單抗組；III組:100μg/m L貝伐珠單抗組；IV組:200 μg/mL貝伐珠單抗組；V組:400μg/mL貝伐珠單抗組；貝伐珠單抗用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.4 方法

1.4.1 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡 (1)配制Hoechst 33258工作液取試劑盒中Hoechst 33258原液用蒸餾水稀釋10倍，即得Hoechst 33258工作液。(2)調(diào)整HaCaT細(xì)胞濃度為1×104/mL，以每孔1 mL接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度貝伐珠單抗，分組同上，培養(yǎng)48 h后小心吸除上清，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次。(3)加入1 mL的4%甲醛溶液，4℃固定細(xì)胞10 min。(4)用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，爬片水紙吸盡周邊的水分。(5)每孔滴加100μL Hoechst 33258工作液，室溫避光染色10 min，PBS溶液沖凈晾干。(6)以340 nm紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/mL接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后更換無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞分組同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下:(1)棄培養(yǎng)基，用1×PBS清洗1次；(2)每孔加入1 mL 0.25%胰酶消化5 min；(3)每孔加入1 mL含血清培養(yǎng)基終止胰酶消化，微量移液器吹打細(xì)胞使其脫落；(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105或1×106個(gè)細(xì)胞移至離心管，1000 r/ min，4℃離心10 min，棄上清；(5)加入1 mL 4℃預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮；(6)1000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；(7)重復(fù)步驟(5)(6)洗滌兩次；(8)將細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer并移至流式管中；(9)加入10μL Annexin V－FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min；(10)上機(jī)前5 min加入300μL Binding Buffer以及5μLPI；(11)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析并儲(chǔ)存凋亡圖。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞周期的影響 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/m L接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后更換無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞分組同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下:(1)PBS洗兩次，0.25%胰酶消化；(2)加含血清的培養(yǎng)基終止消化，移液槍吹打細(xì)胞使其脫落；(3)將細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)離心1000 r/min，5 min，棄上清；(4)輕拍離心管使細(xì)胞脫離管壁，加入2 mL預(yù)冷的PBS；(5)1000 r/min，離心5 min，棄上清；(6)重復(fù)步驟(5)(6)洗滌兩次；(7)輕拍離心管使細(xì)胞脫離管壁，加入1 mL預(yù)冷PBS，輕輕吹勻；(8)在5個(gè)新的離心管內(nèi)加入3 m L－20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇；(9)將(8)中的細(xì)胞懸液高速震蕩下緩慢加入(9)中的離心管中；(10)－20℃冰箱中固定保存，待測(cè)；(11)－20℃冰箱取出樣本，1000 r/min，離心5 min，棄上清；(12)輕拍試管使細(xì)胞脫離管壁，加入3 mL PBS，水合15 min；(13)1000 r/min，離心5 min，棄上清；(14)輕拍離心管使細(xì)胞脫離管壁，加1 mL PI染液，震蕩混勻5～10 s，室溫孵育30 min；(15)流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，分析并儲(chǔ)存周期時(shí)相圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用ˉx±s表示。多個(gè)均數(shù)比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)。相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)性用相關(guān)系數(shù)r表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明對(duì)照組HaCaT細(xì)胞的胞核完整，呈圓形或橢圓形，熒光染色較淺且較均勻，未觀察到凋亡的形態(tài)學(xué)改變；50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL貝伐珠單抗處理后，HaCaT細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚、固縮，部分核染色質(zhì)邊集，或呈碎塊狀致密染色的凋亡形態(tài)學(xué)變化。

2.2 貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表1、圖2。貝伐珠單抗作用HaCaT細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明貝伐珠單抗可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著貝伐珠單抗?jié)舛鹊脑黾親aCaT細(xì)胞凋亡率逐漸增加(r＝0.954，P＜0.05)，其中400μg/mL貝伐珠單抗組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)。

表1 貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

2.3 貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表2、圖3。貝伐珠單抗作用HaCaT細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明各濃度貝伐珠單抗組G0/G1期的細(xì)胞比例不同程度的增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明貝伐珠單抗可有效阻滯HaCaT細(xì)胞的周期進(jìn)程，細(xì)胞周期被阻滯在G0/ G1期，尤以400μg/mL貝伐珠單抗組作用最強(qiáng)。

圖1 HaCaT細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變(Hoechst 33258熒光染色，×400)

圖2 不同濃度貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

圖3 不同濃度貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞周期變化的影響

3 討論

銀屑病的主要病理學(xué)特點(diǎn)是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖、分化異常(角化不全)；表皮與真皮間顯著炎細(xì)胞浸潤(rùn)；真皮乳頭層內(nèi)微血管迂曲、擴(kuò)張、增生。3角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，數(shù)量占表皮細(xì)胞的80%以上。銀屑病患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞抵抗細(xì)胞凋亡的能力增強(qiáng)，可能是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素之一。4

貝伐珠單抗目前主要作為抗血管增生藥物用于腫瘤的臨床治療，主要機(jī)制是阻滯VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而發(fā)揮抗血管增生作用?，F(xiàn)已證實(shí)HaCaT能夠自身分泌VEGF并與細(xì)胞表面的VEGF受體結(jié)合從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。5貝伐珠單抗作為抗VEGF的IgG1單克隆抗體，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制尚不清楚。

表2 貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞細(xì)胞周期變化的影響

本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst33258熒光染色在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示貝伐珠單抗作用于HaCaT細(xì)胞48 h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，HaCaT細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚、固縮，部分核染色質(zhì)邊集，或呈碎塊狀致密染色，而對(duì)照組無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVFITC雙染方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明貝伐珠單抗可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡，且隨著藥物濃度的增加細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。

凋亡是細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下，一種由基因調(diào)控的主動(dòng)性自我消亡過(guò)程，在不引起有害炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上清除功能失調(diào)或衰老的細(xì)胞。凋亡這種獨(dú)特的功能在保持皮膚不斷更新的組織穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵的作用，控制著角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和角質(zhì)層的形成。6凋亡的失調(diào)在增殖性疾病如癌癥或銀屑病的發(fā)生、維持和發(fā)展中起到重要作用，4而細(xì)胞凋亡的平衡有助于過(guò)度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)并使表皮結(jié)構(gòu)正?；?。所以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的藥物可能具有治療銀屑病的潛力。

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示貝伐珠單抗作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期中G0/G1期比例明顯增高，各藥物濃度組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明貝伐珠單抗可影響HaCaT細(xì)胞細(xì)胞周期，把細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制DNA的合成。

一系列的研究證明VEGF的另一個(gè)重要作用就是作為一種促存活因子，可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的存活。7，8Zhu等9的研究進(jìn)一步證實(shí)了角質(zhì)形成細(xì)胞的存活主要是VEGF通過(guò)激活其受體信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并且推測(cè)受體的激活在促進(jìn)細(xì)胞的存活上起到部分作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明貝伐珠單抗可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡，這與Videira等10研究中發(fā)現(xiàn)的貝伐珠單抗誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果相似，我們推測(cè)這可能是貝伐珠單抗阻滯VEGF發(fā)揮其生物學(xué)活性，使得通過(guò)激活受體信號(hào)的促細(xì)胞存活作用無(wú)法實(shí)現(xiàn)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。Videira等10研究中發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗可以阻滯膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在不同的膀胱癌細(xì)胞株中貝伐珠單抗阻滯細(xì)胞周期的作用位點(diǎn)有顯著的差異，我們推測(cè)貝伐珠單抗對(duì)細(xì)胞周期的阻滯可因細(xì)胞的不同而發(fā)生變化，楊曉紅等11證實(shí)貝伐珠單抗可通過(guò)抑制內(nèi)源性VEGF生物學(xué)作用抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，結(jié)合前面本實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果我們推測(cè)，貝伐珠單抗抑制細(xì)胞的增殖作用也有可能是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制DNA合成實(shí)現(xiàn)的。貝伐珠單抗對(duì)HaCaT細(xì)胞確切的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(收稿:2013－09－05 修回:2013－11－15)

Effect of Bevaiczumab on apoptosis and proliferation of HaCaT cells

WU Qian，WEIZhi-ping，LIU Yan-qun，et al.Xuzhou Children'sHospital，Xuzhou，221006

Objective:To investigate the effects of Bevacizumab on apoptosis of HaCaT cells.Methods: HaCaT cells were cultured and treated with Bevacizumab in different concentration(50μg/m l、100μg/m l、200μg/m l、400μg/m l).Themorphological change of HaCaT cells was tested by Hoechst 33258 fluorescent staining.The effects of Bevacizumab on apoptosis of HaCaT cells were detected by flow cytometry.Results: After treated with Bevacizumab for 48 h，the HaCaT cells showed typicalmorphological changes of apoptosis such as chromatin condensation，chromatin margination and nuclei fragments.The results of flow cytometry showed an increase in apoptosis of the cells and the ratio of G0/G1 phase cells was also increased.Conclusion:Bevacizumab can induce apoptosis of HaCaT cells in vitro，and block cell cycle process effectively and arrest the cell cycle at G0/G1 phase.

HaCaT cells；Bevacizumab；apoptosis；proliferation

1徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州，221006

2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇徐州，221000

3靖江市人民醫(yī)院皮膚科，江蘇泰州靖江，214500

?通信作者