劉海平高 華付洪軍

人參皂苷Rb1對過氧化氫誘導的B16F10鼠黑素瘤細胞凋亡的保護作用

劉海平1高 華2付洪軍3

目的: 確定人參皂苷Rb1對過氧化氫誘導的B16F10黑素瘤細胞凋亡的保護作用。方法:將B16F10細胞隨機分為對照組，H2O2組和Rb1＋H2O2組(細胞培養(yǎng)液中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50mg/L的人參皂苷Rb1和H2O2)。分別測定B16F10細胞活力、LDH漏出量、線粒體膜電位及細胞凋亡水平。結(jié)果: H2O2作用24 h后，B16F10細胞活力降低至對照組的53.77%，而Annexin V和PI陽性細胞比例為25.6%，顯著高于對照組(P＜0.01)。50 mg/L人參皂苷Rb1預處理后，B16F10細胞活力為對照組的77.75%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。Annexin V和PI陽性細胞比例為14.4%，明顯低于H2O2組(P＜0.01)，并且LDH漏出率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高。結(jié)論: 人參皂苷Rb1對H2O2所致的B16F10黑素瘤細胞凋亡具有保護作用，有效提高其抗氧化應激能力。

人參皂苷Rb1； B16F10細胞； 凋亡

白癜風是一種獲得性、進行性色素脫失性疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明，但越來越多的證據(jù)表明，氧化應激可能是白癜風黑素細胞缺失的重要原因。過氧化氫(H2O2)是機體氧化代謝的產(chǎn)物，也是一類活性氧自由基(ROS)。1Schallreuter等2研究發(fā)現(xiàn)，進展期白癜風患者表皮內(nèi)H2O2水平升高。體外研究也表明，H2O2能使黑素細胞樹突回縮，形態(tài)改變，抑制黑素細胞增殖和色素合成，故推測H2O2為主的氧化劑在黑素細胞環(huán)節(jié)對白癜風的發(fā)病起重要作用。3人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)內(nèi)含有能夠清除自由基的抗氧化物質(zhì)，不僅可以直接清除氧自由基，也可以通過增強胞漿內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)及過氧化氫酶(CAT)的活性間接清除氧自由基。4本實驗以H2O2損傷B16F10鼠黑素瘤細胞造成氧化應激損傷模型，觀察人參皂苷Rb1對黑素瘤細胞的保護作用，并從細胞活力和細胞凋亡等方面闡明其作用機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，人參皂苷Rb1購于南京廣潤生物制品有限公司，四氮唑藍(MTT)和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC－1)購自Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Annexin V＆PI凋亡檢測試劑盒購自Calbiochem公司。B16F10鼠黑素瘤細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗分組 常規(guī)培養(yǎng)的B16F10細胞隨機分組:①對照組，細胞培養(yǎng)液不加任何處理因素，37℃培養(yǎng)24 h；②H2O2組，細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100μM的H2O2，37℃培養(yǎng)24 h；③Rb1＋H2O2組，將培養(yǎng)的B16F10細胞中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的人參皂苷Rb1預處理6 h后，細胞培養(yǎng)液中加入終濃度100μM的H2O2，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測及方法

1.3.1 MTT法測定B16F10細胞活力 各組細胞接種于96孔板，細胞密度為1×104cells/孔，每組8孔，每孔加MTT溶液10μL(5 g/L)，37℃孵育4 h；棄上清，每孔加入100μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。于波長570 nm處測各孔吸光度(A)值，各組細胞活力以占對照組百分比表示。

1.3.2 LDH漏出量測定 收集各組細胞，離心、取上清，按說明書以分光光度計比色法測定細胞培養(yǎng)上清LDH漏出量。

1.3.3 JC－1線粒體功能檢測 收集各組細胞(2× 105cells/組)，用預溫(37℃)的完全培養(yǎng)基調(diào)整至1 mL。細胞懸液加入JC－1儲存液(1 mg/mL)2.5μL，振蕩細胞懸液直至標本形成均一的紅紫色；37℃避光保存10 min。加入2 m L PBS至細胞懸液中，2000 r/ min室溫離心5 min，去上清；以0.3 mL PBS重懸細胞，流式細胞儀分析。用發(fā)紅色熒光細胞百分率(JC－1＋%)表示線粒體膜電位正常細胞的比例。

1.3.4 Annexin V＆PI法檢測細胞凋亡 收集各組細胞(3×105cells/組)，用PBS洗滌2次(2000 r/min離心5 min)，棄上清；加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞；細胞懸液中加入5μL Annexin V－FITC混勻后，然后加入5μL PI混勻；室溫、避光、反應5～15 min，流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖采用SigmaPlot8.0軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞活力的影響 見圖1。MTT結(jié)果顯示:H2O2組B16F10鼠黑素瘤細胞活力為對照組細胞活力的(53.77±5.54)%，顯著低于對照組(P＜0.01)；10 mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組細胞活力分別為對照組細胞活力的(56.74±2.96)%、(61.61±3.48)%，與H2O2組比較無顯著差異(P＝0.255和P＝0.097)；50mg/L Rb1＋H2O2組細胞活力為對照組細胞活力的(77.75± 4.41)%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。

圖1 人參皂苷Rb1對B16F10細胞活力的影響

2.2 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞LDH漏出量的影響 見表1。與對照組相比，H2O2組LDH漏出量明顯增加(P＜0.01)；與H2O2組相比，50 mg/LRb1＋H2O2組LDH漏出量顯著降低(P＜0.01)；而10mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組LDH漏出量無明顯降低(P＝0.173和P＝0.085)。

2.3 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞線粒體膜電位的影響 見表1。H2O2處理后，B16F10細胞線粒體膜電位較對照組顯著降低(P＜0.01)；10 mg/L和20 mg/L Rb1預處理后，線粒體膜電位與H2O2組無顯著差異(P＝0.227和P＝0.075)；而50 mg/L Rb1預處理后線粒體膜電位明顯升高(P＜0.01)。結(jié)果提示，50 mg/L人參皂苷Rb1具有保護線粒體，減輕H2O2對細胞線粒體的損傷。

表1 B16F10細胞LDH漏出量和線粒體膜電位(MMP)的變化

2.4 人參皂苷Rb1對H2O2致B16F10細胞凋亡的影響 見圖2。流式結(jié)果顯示，對照組Annexin V陽性細胞比例(4.2±1.2)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(8.1±1.8)%。給予H2O2處理后，凋亡水平明顯增加(P＜0.01)，Annexin V陽性細胞比例(17.3±2.5)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(25.6±3.7)%。給予人參皂苷Rb1(50mg/L)預處理后，Annexin V陽性細胞比例(9.5±2.6)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(14.4±4.0)%，統(tǒng)計結(jié)果顯示明顯降低了凋亡水平(P＜0.01)。而10 mg/L和20 mg/L人參皂苷Rb1作用無統(tǒng)計學意義(P＝0.437和P＝0.195)。

圖2 人參皂苷Rb1對H2O2致B16F10細胞凋亡的影響

3 討論

H2O2是一種活性氧自由基(ROS)，能自由穿過細胞膜、核膜與金屬離子反應，產(chǎn)生羥自由基，羥自由基可以與嘌呤和嘧啶發(fā)生反應，損傷細胞DNA。5，6ROS還能作為細胞內(nèi)信使激活轉(zhuǎn)錄因子，通過影響基因轉(zhuǎn)錄，促使凋亡基因上調(diào)，誘導細胞發(fā)生凋亡。7目前研究表明，低濃度(小于100μM)H2O2主要導致細胞凋亡，高濃度H2O2主要導致細胞壞死。8本研究結(jié)果表明，B16F10黑素瘤細胞在H2O2作用下細胞活力和線粒體膜電位均下降，培養(yǎng)上清中LDH漏出量及細胞凋亡率增加，說明H2O2可通過誘導氧化應激引起黑素瘤細胞的凋亡。

由于氧化應激在白癜風發(fā)病機制中的重要作用，抗氧化劑在白癜風治療中的作用逐漸引起重視。9Jeong等10研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和綠茶提取物具有較強的抗氧化作用，可以抵抗氧化應急對細胞的損傷，對H2O2誘導的Mel－Ab細胞損傷具有保護作用。Rojas等11研究發(fā)現(xiàn)，外用抗氧化劑及線粒體刺激劑聯(lián)合口服抗氧化劑及苯丙氨酸治療穩(wěn)定型白癜風療效最好。作者分析該療法可能是通過糾正ROS造成的細胞和線粒體損傷使黑素細胞功能得到恢復。本實驗使用的人參皂苷Rb1是近年來研究較多的一類人參單體，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增強記憶力等功效。4，12

50 mg/L人參皂苷Rb1預處理后H2O2所致B16F10黑素瘤細胞活力降低明顯受到抑制，減少了細胞凋亡的發(fā)生，這說明人參皂苷Rb1對氧化應激損傷致B16F10細胞凋亡具有保護作用。此外，實驗結(jié)果還顯示，50 mg/L人參皂苷Rb1能夠有效地減少細胞內(nèi)LDH漏出量，部分恢復細胞線粒體膜電位水平。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體除了具有細胞能量轉(zhuǎn)換的功能，還是參與細胞凋亡的重要細胞器，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。本研究結(jié)果提示，人參皂苷Rb1抗細胞凋亡的作用與減少細胞內(nèi)ROS過氧化損傷和保護線粒體功能有關。

人參具有保護機體細胞免受應激損傷的作用。本研究觀察用人參的有效成分人參皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤細胞抗氧化應激的作用，為臨床應用人參提取物治療白癜風提供了實驗依據(jù)。

1 Cao CZ，Bu LS，Gao S，et al.The injured effect of hydrogen peroxide on cultured cardiac myocytes.Prog Biochem Biophys，2000，27(6):628－632.

2 Schallreuter KU，Moore J，Wood JM，et al.Epidermal H2O2accumulation alters tetrahydrobiopterin(6BH4)recycling in vitiligo:identification of a general mechanism in regulation of all 6BH4－dependent processes.J Invest Dermatol，2001，116(1): 167－174.

3 Cario－Andre M，Gauthier Y，Pain C，et al.SP－21 Ex vivo vitiligo vs control melanocyte susceptibility to catecholam ines and hydrogen peroxide.Pigment Cell Res，2003，16(5):587－588.

4 Li YK，Chen XC，Zhu YG.Ginsenoside Rb1 attenuates okadaic acid－induced Tau protein hyperphosphorylation in rathippocampal neurons.Acta Physiologic Sinica，2005，57(2):154－160.

5Yildirim M，Baysal V，Inaloz HS，et al.The role of oxidants and antioxidants in generalized vitiligo at tissue level.JEur Acad Dermatol Venereol，2004，18(6):683－686.

6 Rokos H，Beazley WD，Schallreuter KU.Oxidative stress in vitiligo:photo－oxidation of pterins produces H2O2and pterin－6－carboxylic acid.Biochem Biophys Res Commun，2002，292(4): 805－811.

7 Sakamoto T，Repasky WT，Uchida K，et al.Modulation of cell death pathways to apoptosis and necrosis of H2O2－treated rat thymocytes by lipocortin I.Biochem Biophys Res Commun，1996，220(3):643－647.

8 Von Harsdorf R，Li PF，Dietz R.Signaling pathways in reactive oxygen species induced cardiomyocyte apoptosis.Circulation，1999，99(22):2934－2941.

9劉邦民，堅哲，李春英，等.抗氧化應激中藥在白癜風治療中的潛在應用.中國美容醫(yī)學，2012，21(8):1363－1366.

10 Jeong YM，Choi YG，Kim DS，et al.Cytoprotective effect of green tea extract and quercetin against hudrogen peroxide－induced oxidative stress.Arch Pharm Res，2005，28(1):1251－1256.

11 Rojas JE，Poleo AG.Evaluation of an antioxidant andmitochondria－stimulating cream formula on the skin of patients withstable common vitiligo.Invest Clin，2007，48:21－31.

12 Chen XC，Zhou YC，Chen Y，et al.Ginsenoside Rg1 reduces MPTP2 Induced substantianigra neuron loss by suppressing oxidative stress.Acta Pharmacol Sinica，2005，26(1):56－62.

(收稿:2013－09－03 修回:2013－12－07)

Protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2

LIU Hai-ping，GAO Hua，F(xiàn)U Hong-jun.Department of Dermatology，Beijing Tieying Hospital，Beijing，100078

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2.Methods:B16F10 cellswere random ly divided into blank control group，H2O2group and Rb1＋H2O2group.In the Rb1＋H2O2group B16F10 cells were cultured with ginsenoside Rb1(in three doses of 10mg/L，20mg/L and 50mg/L)before treated with H2O2.The viability of B16F10 cellswas calculated by MTT assay.The outleakage of lactate dehydrogenase(LDH)，mitochondrialmembrane potential and the level of apoptosisweremeasured accordingly.Results:After treated with H2O2for 24h，the viability of B16F10 cells decreased to 53.77%of the control group，while the proportion of Annexin V＆PIpositive cells significantly increased to 25.6%of the control group(P＜0.01).When pre－treated with 50mg/LRb1，the cell viability increased to 77.75%of the control group，which was 44.6%higher than that of the H2O2group(P＜0.01).The proportion of Annexin V＆PI positive cells significantly decreased to 14.4%compared with H2O2group(P＜0.01).Meanwhile ginsenoside Rb1(50mg/L)significantly decreased LDH outleakage and inhibited the decrease ofmitochondrialmembrane potential.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can protect the B16F10 cells against H2O2－induced apoptosis and effectively improve the ability of antioxidative stress.

ginsenoside Rb1；B16F10 cells；apoptosis

1北京豐臺區(qū)鐵營醫(yī)院皮膚科，北京，100078

2首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050

3山東濟寧市第一人民醫(yī)院，濟寧，272011