胡小平 張 偉 陳辦成 陳史宏 王勇強(qiáng) 于 波

·論著·

PPARβ/δ激動(dòng)劑GW501516對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移和粘附的影響

胡小平 張 偉 陳辦成 陳史宏 王勇強(qiáng) 于 波

目的: 評(píng)價(jià)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)的激動(dòng)劑GW501516對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)增殖、遷移和粘附的影響。方法: 體外培養(yǎng)正常人KC，采用MTT比色法及體外計(jì)數(shù)法，觀察正常人KC在不同濃度GW501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/m l)作用下，其增殖、遷移及粘附情況。結(jié)果: 與對(duì)照組比較，GW501516促進(jìn)KC增殖(P＜0.01)，呈劑量依賴性；GW501516顯著促進(jìn)了KC的遷移(P＜0.001)；細(xì)胞粘附性與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論: GW501516能夠促進(jìn)人KC增殖和遷移，對(duì)KC粘附無(wú)影響。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體； GW501516； 角質(zhì)形成細(xì)胞； 增殖； 遷移； 粘附

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator－activated receptors，PPARs)是一類激素核受體超家族成員?，F(xiàn)已證實(shí)有三種不同的PPARs亞型:PPARα、PPARβ/δ、PPARγ。近年來(lái)，對(duì)于PPARs和炎癥性皮膚病的關(guān)系受到了學(xué)者們的關(guān)注。1而人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)中，PPARβ/δ是主要的亞型。研究發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ在增殖的HaCaT細(xì)胞和銀屑病皮損中表達(dá)明顯上升，2提示PPARβ/δ可能和KC增殖具有一定的關(guān)系。為進(jìn)一步了解PPARβ/δ對(duì)KC的影響，我們選擇PPARβ/δ的激動(dòng)劑GW501516和KC體外共同培養(yǎng)，研究PPARβ/δ激活后對(duì)KC的增殖、遷移和粘附功能作用的影響。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和材料 15名正常人(19～58歲)健康皮膚來(lái)自我院皮膚科和整形外科，均按照知情同意的原則留取組織標(biāo)本。無(wú)血清KC培養(yǎng)基(KSFM，含5μg/mL的慶大霉素)，0.5%dispase分離酶(Gibco，美國(guó))，胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA(Peprotech，美國(guó))；GW501516試劑(上海浩天然生物技術(shù)有限公司)；MTT；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio，美國(guó))；其他試劑及器材:T－75培養(yǎng)瓶(Fluka，UK)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、12孔板、96孔板(Costar，美國(guó))等。

1.2 表皮KC的分離和培養(yǎng) 無(wú)菌手術(shù)后保存在0.5%dispase分離酶中的正常人皮膚標(biāo)本在4℃過(guò)夜后，無(wú)菌操作臺(tái)中分離表皮和真皮。將分離下的表皮置于0.25%的胰酶中，37℃靜置10 min。然后以胎牛血清中止胰酶的活性，輕輕吹打表皮，以200目濾網(wǎng)過(guò)濾KC懸液，1000 r/min離心7min。然后，棄上清，加入KSFM，將正常表皮KC種植于T－75培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)、傳代，所有的實(shí)驗(yàn)均利用2～3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KC。

1.3 MTT法檢測(cè)GW501516對(duì)KC增殖的影響MTT法參照文獻(xiàn)，3略加改變。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KC用胰酶/EDTA消化后重懸于KSFM，以5×104/mL密度種植于96孔板，每孔100μL。放置于培養(yǎng)箱中，細(xì)胞鋪滿孔底部60%～70%后，棄培養(yǎng)基，然后用PBS沖洗兩次。加入100μL含有不同濃度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/m L)的基礎(chǔ)KSFM中，繼續(xù)孵育48 h。最后每孔加入2μL用PBS配置的MTT(5mg/ mL)。放置于孵箱中3 h后，棄除培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO后置于水平振蕩器上振蕩，然后置于分光光密度儀570 nm讀取吸光度值。每種處理因素均設(shè)6復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GW 501516對(duì)KC遷移能力的影響 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)參照既往的研究方法，4略加改變。改良Boyden chambers中裝入8μm孔徑的PVP膜，PVP膜光滑面預(yù)先用20μg/mL IV型膠原40℃預(yù)孵育24 h并在室溫下風(fēng)干，光面向下。趨化盒的下層每孔加入27μL含有不同濃度GW 501516 (0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)的基礎(chǔ)KSFM，上層加入50μL密度為5×104/m L的基礎(chǔ)KSFM混懸的HaCaT細(xì)胞懸液。放置于培養(yǎng)箱中12 h后，取出PVP膜，小心刮去正面的非遷移性的細(xì)胞，保留朝下的光滑面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，2%結(jié)晶紫染色5 min后流水沖洗，在光鏡400×放大倍數(shù)每孔隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移到光滑面的細(xì)胞，5個(gè)視野計(jì)數(shù)之和代表每孔的細(xì)胞遷移數(shù)目。每種處理因素均設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GW 501516對(duì)正常表皮KC粘附能力的影響 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KC用胰酶/EDTA消化后用PBS沖洗2次后重懸于基礎(chǔ)無(wú)血清KC培養(yǎng)基，以1×105/mL密度種植于20μg/mL IV型膠原預(yù)包被的96孔板，每孔100μL，同時(shí)加入不同濃度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后棄培養(yǎng)基，然后用37℃預(yù)熱的無(wú)血清KC培養(yǎng)基輕輕沖洗3次以去除未粘附的細(xì)胞，每孔加入20μL用PBS配置的MTT(5 mg/mL)，放置于培養(yǎng)箱中3 h后，加入100μLDMSO后水平振蕩器振蕩5min后，置于分光光密度儀570 nm讀取吸光度。每種處理因素均設(shè)6復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，多組均值間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

GW501516呈劑量依耐性的促進(jìn)KC增殖，50 ng/ mL時(shí)達(dá)到峰值。GW501516能顯著促進(jìn)KC的遷移，濃度在100 ng/mL時(shí)約是對(duì)照組的11倍。GW501516對(duì)KC粘附作用無(wú)影響(P＞0.05)。見(jiàn)表1、圖1～3。

圖1 GW501516對(duì)KC促增殖效應(yīng)。GW501516呈劑量依耐性的促進(jìn)KC增殖，50 ng/mL時(shí)達(dá)到峰值。?表示在GW501516處理組和未處理組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(?:P＜0.05；???:P＜0.001)

圖2 GW501516對(duì)KC遷移的影響。GW501516能顯著促進(jìn)細(xì)胞的遷移。???表示在GW501516處理組和未處理組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)

圖3 GW501516對(duì)KC粘附作用的影響

表1 GW501516對(duì)正常KC增殖、遷移和黏附的影響

3 討論

一系列研究發(fā)現(xiàn)，PPARs被相應(yīng)的激動(dòng)劑活化后，在皮膚和其他器官中可調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞功能，這些新的功能支持PPARs和相應(yīng)激動(dòng)劑可作為治療不同皮膚病的潛在靶位。5人皮膚KC中，PPARβ/δ是主要的亞型，已有研究認(rèn)為PPARβ/δ與表皮分化有關(guān)。6盡管內(nèi)源性PPARβ/δ配體激動(dòng)劑的本質(zhì)仍不清楚，但幾種化學(xué)合成的激動(dòng)劑如GW 501516已在研究PPARβ/δ生理功能的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。

在已發(fā)表的研究中，PPARβ/δ對(duì)表皮的增殖作用存在爭(zhēng)議，一些研究認(rèn)為PPARβ/δ的激活促進(jìn)了表皮細(xì)胞的增殖，7而另一些研究認(rèn)為其活化后會(huì)抑制表皮細(xì)胞增殖。8，9近年來(lái)，在一些KC增生性疾病中如銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ表達(dá)明顯增加，2并且小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ活化能夠觸發(fā)銀屑病特征性的免疫反應(yīng)，引起銀屑病樣皮膚損害。10這些研究似乎更傾向于表明PPARβ/δ的激活具有促進(jìn)表皮KC增殖作用。Tan等研究發(fā)現(xiàn)，PPARβ/δ在皮膚傷口愈合過(guò)程中有重要的作用，11表明PPARβ/δ活化促進(jìn)了表皮細(xì)胞的遷移功能。對(duì)于這些研究現(xiàn)象的爭(zhēng)議，目前的解釋認(rèn)為:細(xì)胞中PPARβ/δ活化可能存在雙相反應(yīng)，這種反應(yīng)主要依賴于炎癥信號(hào)所誘發(fā)的變量情況，即在炎癥刺激作用下，PPARβ/δ表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，而在非炎癥情況下表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖功能。

本研究發(fā)現(xiàn)PPARβ/δ在激動(dòng)劑GW 501516的活化下，對(duì)正常KC具有明顯的促增殖和遷移作用，而對(duì)細(xì)胞粘附功能無(wú)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了PPARβ/δ促增殖和遷移的功能，但炎癥刺激理論并不能解釋這種正常情況下的PPARβ/δ所產(chǎn)生的促增殖和遷移的效應(yīng)，但由于實(shí)驗(yàn)中使用了外源性激動(dòng)劑GW501516，可能也說(shuō)明體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不能真實(shí)反映PPARβ/δ在體內(nèi)時(shí)的實(shí)際功能，因?yàn)樾枰獙?duì)PPARβ/δ產(chǎn)生作用的機(jī)理進(jìn)一步深入研究。近期發(fā)現(xiàn)了一種新的KC增殖和分化穩(wěn)態(tài)控制路徑，即PPARβ/δ憑借調(diào)節(jié)皮膚成纖維細(xì)胞的IL－1信號(hào)，12為解釋此現(xiàn)象帶來(lái)了希望。

本研究結(jié)果顯示，PPARβ/δ促進(jìn)KC增殖和遷移功能與激動(dòng)劑GW501516的工作濃度呈劑量依耐性，這說(shuō)明激動(dòng)劑的濃度大小影響和調(diào)節(jié)了PPARβ/δ的促增殖和遷移效應(yīng)，這可能從另外角度說(shuō)明正常非炎癥情況下，雖然表皮KC細(xì)胞中有PPARβ/δ的表達(dá)，但由于無(wú)激動(dòng)劑活化，PPARβ/δ不會(huì)促進(jìn)正常的KC細(xì)胞增殖和遷移。這也間接支持了炎癥狀態(tài)下PPARβ/δ的促增殖效應(yīng)。另外，研究結(jié)果顯示PPARβ/δ對(duì)KC的粘附作用無(wú)影響，而粘附功能在炎癥因子趨化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這提示PPARβ/δ可能對(duì)炎癥過(guò)程無(wú)調(diào)節(jié)作用。

總之，結(jié)合相關(guān)研究，13說(shuō)明PPARβ/δ在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和遷移以及修復(fù)等方面具有重要作用，尤其可能在增殖性炎癥性皮膚病發(fā)病機(jī)制中有重要影響，表明其將來(lái)可能成為治療此類疾病的藥物作用靶點(diǎn)。

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(收稿:2013－11－17 修回:2014－01－05)

Effects of PPARβ/δagonist GW 501516 on the proliferation，m igration and attachment of human keratinocytes in vitro

HU Xiao-ping，ZHANGWei，CHEN Ban-cheng，etal.Department ofDermatology，Shenzhen Hospital，Peking University，Guangdong，518036

Objective:To investigate the influence of peroxisome proliferator receptorβ/δ(PPARβ/δ)agonist GW501516 on the proliferation，migration and attachment of cultured human keratinocytes(KC).Methods:After the KCs were treated with different concentrations of GW 501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/ m l)，the cell proliferation，migration and attachmentweremeasured by MTTmethod.Results:Compared with control group，GW 501516 significantly increased the cell proliferation(P＜0.001)，in a dose－dependentmanner，and markedly promoted the cellmigration(P＜0.001).There was no significant difference in the cell attachmentbetween the experimental group and control group(P＞0.05).Conclusion:The results demonstrate that GW501516 can stimulate human KC proliferation andmigaration，but has no effect on KC attachment.

peroxisome proliferator receptor；GW 501516；human keratinocytes；proliferation；migration；attachment

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):S2012040006694)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(編號(hào):B2012329)

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):201203035)

北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，廣東深圳，518036