賈光鋒，趙晨，陸文總，伊康，蘇加強(qiáng)

（西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安710032）

超聲波輔助提取白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的研究

賈光鋒，趙晨，陸文總，伊康，蘇加強(qiáng)

（西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安710032）

a-淀粉酶抑制劑（AAI）具有明顯的降血糖和減肥功效。本研究利用超聲波技術(shù)提取白蕓豆中的AAI，探討了堿液濃度、液固比、超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間5個(gè)因素對(duì)AAI產(chǎn)量的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度37℃、超聲功率110W和超聲時(shí)間20min。超聲波技術(shù)可以快速高效地提取白蕓豆中的AAI，并保持其生物活性，具有綠色環(huán)保的現(xiàn)實(shí)意義。

超聲波；白蕓豆；a-淀粉酶抑制劑

α-淀粉酶抑制劑（alpha amylase inhibitor，簡(jiǎn)稱AAI）是一種能降低α-1，4糖苷水解酶活性的抑制劑。它可以通過抑制腸道內(nèi)唾液淀粉酶和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的吸收，從而降低人體血糖和血脂含量水平，具有防治糖尿病[1]、肥胖[2]、高血脂[3]等病癥的作用。

天然來源的AAI以其副作用低、作用明顯和生物相容性高的特點(diǎn)已受到越來越多醫(yī)患的青睞，尤其是白蕓豆AAI的生物效價(jià)較高[4]，對(duì)哺乳動(dòng)物的胰α-淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用。目前，傳統(tǒng)的加熱溶劑浸提法在制備AAI時(shí)，具有能耗高、溶劑消耗大、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、環(huán)保壓力大、產(chǎn)品質(zhì)量低、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)。本研究將聯(lián)合使用超聲強(qiáng)化萃取技術(shù)和微波快速滅酶技術(shù)，旨在提高AAI的產(chǎn)量和活性，具有顯著的現(xiàn)實(shí)意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1原料

白蕓豆（市售，能夠發(fā)芽）粉碎成60目，備用。

1.1.2主要試劑及儀器

豬胰α-淀粉酶：sigma公司；可溶性淀粉、麥芽糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、氫氧化鈉和葡萄糖等均為分析純。KQ3200DE超聲波清洗機(jī)：昆山超聲儀器；ER-761MD微波爐：青島海爾；UV-1700可見-紫外分光光度計(jì)：日本島津。

1.2方法

1.2.1提取AAI

稱取白蕓豆粉1.0 g按照一定液固比分散于特定濃度的NaOH溶液中，超聲處理一定時(shí)間，10 000 r/min離心20min，取上清液用微波爐加熱使酶滅活，冷卻至室溫，10 000 r/min離心30min，上清液用70%乙醇于4℃沉淀，過濾，減壓干燥，即得AAI粗品，稱重，結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.2單因素試驗(yàn)

利用超聲波提取白蕓豆中的AAI時(shí)，主要分別討論液固比、堿液濃度、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度5個(gè)因素對(duì)AAI產(chǎn)量的影響。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）和超聲功率（C）三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，探討各因素的相互交叉影響，以α-AI產(chǎn)量為指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。

表1　L9（34）正交試驗(yàn)表Table1 Orthogonal test design L9（34）

1.3.4AAI的活性測(cè)定—DNS法[5]

AAI（樣品）和水（對(duì)照品）分別與α-淀粉酶在37℃下反應(yīng)15min后，再加入淀粉溶液準(zhǔn)確反應(yīng)5min，最后利用DNS溶液沸水反應(yīng)5min，冷卻至室溫，在470 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定顯色液的吸光度OD和OD′值，計(jì)算AAI的抑制率。

AAI的抑制率（%）=（OD′-OD）/OD′

2　結(jié)果與討論

2.1單因素結(jié)果分析

2.1.1堿液濃度對(duì)提取效果的影響

在液固比5∶1、超聲溫度30℃、超聲時(shí)間15min、超聲功率120W條件下，研究堿液（NaOH）濃度對(duì)AAI產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1　堿液濃度對(duì)AAI產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of base solution concentration on the yield of AAI

由圖1可以看出，隨堿液濃度的升高，AAI的產(chǎn)量隨之增加，但當(dāng)堿液濃度超過4%后，AAI產(chǎn)量幾乎不再增加，說明白蕓豆中的AAI已經(jīng)完全萃取出來。因此，選擇4%的堿液濃度足夠提取白蕓豆中的AAI。

2.1.2液固比對(duì)提取效果的影響

在超聲溫度30℃、超聲時(shí)間15min、超聲功率120W、堿液濃度4%條件下，研究不同液固比對(duì)AAI產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　液固比對(duì)AAI產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of AAI

由圖2可以看出，當(dāng)液固比低于10∶1（mL/g）時(shí)，隨著液固比的增大，AAI的產(chǎn)量呈線性顯著增加；當(dāng)液固比超過10∶1（mL/g）時(shí)，AAI產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，這可能是AAI的溶出度已達(dá)到最大值，其產(chǎn)量不再受提取溶劑量的增加而升高。故選擇液固比10∶1（mL/g）較為合適。

2.1.3超聲功率對(duì)提取效果的影響

在超聲溫度30℃、超聲時(shí)間15 min、液固比7∶1（mL/g）、堿液濃度4%條件下，研究超聲功率對(duì)白蕓豆AAI產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　超聲功率對(duì)AAI產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield of AAI

由圖3可知，隨超聲功率的增大，AAI產(chǎn)量出現(xiàn)先增加后減小的變化。當(dāng)超聲功率為120W時(shí)，AAI的產(chǎn)量達(dá)到最大值（57.7mg），但當(dāng)超聲功率升高到150W時(shí)，AAI產(chǎn)量迅速降低。這可能是因?yàn)檫^高的超聲功率容易產(chǎn)生大量的熱能，導(dǎo)致非耐熱型AAI變性。所以，提取白蕓豆AAI的超聲功率為120W。

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在超聲功率120W、超聲溫度30℃、液固比7∶1（mL/g）、堿液濃度4%的條件下，研究不同超聲時(shí)間對(duì)白蕓豆AAI產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)AAI產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on the yield of AAI

由圖4可知，隨超聲時(shí)間的增加，AAI產(chǎn)量先快速增加后緩慢下降；且在20min時(shí)，AAI的產(chǎn)量達(dá)到最大值（61.7mg）?？赡芤?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間超過20min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不斷積累的超聲熱能引起部分AAI變性。因此，超聲反應(yīng)時(shí)間為20min左右可以獲得高產(chǎn)的AAI。

2.1.5超聲溫度對(duì)提取效果的影響

在超聲功率120W、超聲時(shí)間15min、液固比7∶1（mL/g）、堿液濃度4%條件下，研究超聲溫度對(duì)AAI產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5　超聲溫度對(duì)AAI產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of ultrasound temperature on the yield of AAI

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，AAI產(chǎn)量先增加后減?。磺以?5℃時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值（60.9mg）。但當(dāng)超聲溫度超過35℃時(shí)，AAI產(chǎn)量緩慢下降，同樣可能是因?yàn)闊嶙冃砸鸬?。因此，為了獲得高產(chǎn)的AAI，超聲反應(yīng)溫度應(yīng)為35℃。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1正交試驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)α-AI提取效果影響研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲功率3個(gè)因素，以產(chǎn)量和抑制率為指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，極差分析和方差分析結(jié)果如表2和表3所示。

表2　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal experiment

由表2可以看出：3個(gè)因素對(duì)AAI的產(chǎn)量影響顯著性順序?yàn)椋篈＞C＞B，最佳工藝參數(shù)組合為A3B2C1，即超聲溫度37℃，超聲功率110W；超聲時(shí)間20min。由表3的方差分析結(jié)果可以看出：超聲溫度和超聲功率對(duì)AAI產(chǎn)量影響顯著，而超聲時(shí)間影響不顯著。

表3　方差分析結(jié)果Table3 Analysis on variance about orthogonal test data

2.2.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定正交分析的最佳工藝條件，現(xiàn)對(duì)A3B2C1參數(shù)組合重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，加以驗(yàn)證，結(jié)果如表4所示。

表4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of verification test

由表4可知：驗(yàn)證結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果完全一致，說明正交實(shí)驗(yàn)分析不存在偶然性或誤差。因此，超聲波提取白蕓豆AAI的最佳工藝條件為A3B2C1，即超聲溫度37℃、超聲功率110W和超聲時(shí)間20min。在此條件下，1 g白蕓豆可以提取出約72mg AAI粗品，其抑制率均值約為43%。

3　結(jié)論

利用超聲波提取白蕓豆中的AAI時(shí)，探討堿液濃度、液固比、超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)AAI產(chǎn)量的影響，并在此基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度37℃、超聲功率110W和超聲時(shí)間20min。在此條件下，可以獲得高產(chǎn)量和高抑制活性的白蕓豆AAI。

[1]Spadafranca A,Rinelli S,Riva A,et al.Phaseolus vulgaris extract affects glycometabolic and appetite control in healthy human subjects[J].British Journal of Nutrition,2013,109(10)：1789-1795

[2]陳一昆,李欽,趙琎,等.蕓豆提取物α-淀粉酶抑制劑對(duì)SD大鼠的減肥效果研究[J].食品科技,2012,37(10)：207-210

[3]Barrett ML,Udani JK.A proprietary alpha-amylase inhibitor from white bean(Phaseolus vulgaris)：a review of clinical studies on weight loss and glycemic control[J].Nutr J,2011,10(1)：24

[4]Obiro WC,Zhang T,Jiang B.The nutraceutical role of the Phaseolus vulgaris a-amylase inhibitor[J].British Journal of Nutrition,2008, 100(1)：1-12

[5]趙蓉,李多偉,任濤,等.DNS比色法測(cè)定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的活性的方法研究[J].中成藥,2013,35(3)：573-576

Investigation on Alpha Amylase Inhibitor Extracted from White Kidney Bean by Ultrasound

JIA Guang-feng，ZHAO Chen，LU Wen-zong，YI Kang，SU Jia-qiang
（Department of Biomedical Engineering，School of Electronics and Information Engineering，Xi'an Technological University，Xi'an 710032，Shaanxi，China）

Alpha amylase inhibitor（AAI）plays a role in regulating blood sugar and reducing weight obviously. Ultrasound was utilized to extract AAI from white kidney bean in this investigation.A serious of factors including base concernment，liquid-solid ratio，ultrasound temperature，ultrasound power and ultrasound time were analyzed about their effects on the yield of AAI.On that basis，the subsequent orthogonal experiment was carried out to optimize the following process parameters:ultrasonic temperature 37℃，ultrasonic power 110 W and ultrasonic time 20min.Ultrasound extraction technology could quickly and efficiently extract AAI from white kidney bean and keep its bioactivity，which will play the practical significance to the environmental protection.

ultrasound；white kidney bean；alpha amylase inhibitor

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.010

2014-08-05

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（12JK596）；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（1374）

賈光鋒（1977—），男（漢），副教授，博士，主要研究方向：天然產(chǎn)物的分離與純化。