王雅一

(重慶體育科學研究所，重慶 400015)

離心運動導致骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的改變已經(jīng)被很多學者研究證實，目前的研究結(jié)果認為肌肉收縮時產(chǎn)生的機械牽拉可破壞肌細胞的超微結(jié)構(gòu),造成肌肉損傷,稱為運動性骨骼肌損傷(EIMI)[1]。有學者認為，大強度運動導致骨骼肌肌節(jié)重塑，使再次運動時導致的肌肉損傷減輕[2-4]。本研究通過為期7天的離心運動訓練觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷程度以及通過測定增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，進一步探討骨骼肌自我修復的過程。

PCNA(proliferating cell nuclear antigen),又稱周期蛋白(Cy-clin),是一種僅在增殖細胞內(nèi)合成和表達的酸性多肽，其主要表達在細胞周期G1-S期的增殖細胞中,是真核細胞DNA合成所必須的一種核蛋白。在靜止期細胞中的含量很少,G1晚期開始增加,S期達到高峰,在G2期和M期逐漸減少到含量甚微，這表明PCNA的出現(xiàn)與細胞增殖周期密切相關(guān)，是反映細胞增殖活性的重要生物學指標,PCNA可與蛋白因子結(jié)合參與細胞周期調(diào)控、DNA修復以及細胞凋亡等過程。

1 材料與方法

1.1 動物分組及取樣

實驗動物為清潔級健康雄性(Sprague dawley)大鼠36只，6周齡，平均體重為200±13.42g,動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2007-0001，國家標準固體混合飼料喂養(yǎng),自由飲水。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組6只。實驗分組為:安靜對照組(control,C)此組不進行任何訓練。運動組大鼠在尾部負重為3%體重，并進行連續(xù)7天的力竭游泳運動。分為力竭運動后即刻(Exhaustive,E0)、恢復12h組(E12)、恢復24h組(E24)、恢復48h組(E48)、恢復72h組(E72)，均為末次力竭后宰殺。

1.2 取樣和切片的制備

取材時間在力竭運動組末次運動結(jié)束后，清醒、空腹狀態(tài)下，烏拉坦腹腔麻醉，迅速取一側(cè)脛骨前肌，置于2.5%戊二醛固定，用于制作電鏡超薄切片。取另外一側(cè)置于液氮保存，用于免疫印跡。

組織取材后，從對照組、力竭E0、E24組隨機抽取6只大鼠的骨骼肌標本，立刻投入4%的多聚甲醛中固定2h以上，磷酸緩沖液清洗后在1%的鋨酸溶液中固定1h，然后按常規(guī)電鏡樣本制備方法脫水、滲透、包埋、超薄切片。在透射電鏡下定性觀察組織細胞核及線粒體等細胞器的形態(tài)變化以及肌纖維超微結(jié)構(gòu)損傷程度。

1.3 增殖細胞核抗原(PCNA)檢測

采用western blot法測定，電泳儀型號為DYY-6C，來自北京六一儀器廠，電泳槽型號為Mini-垂直165-8000，來自BIO-RAD公司，轉(zhuǎn)移槽型號為VE-186，來自 Tanon公司，實驗過程嚴格按照標準的western blot程序進行。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)通過SPSS17.0統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以標準差形式表示“X±S”，各統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗,P<0.05表示為顯著性差異,P<0.01表示為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠骨骼肌在大負荷運動后以及恢復期超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡顯示：大鼠安靜狀態(tài)下，清晰可見大鼠骨骼肌肌絲完整，Z線并無斷裂或是扭曲，細胞器外膜完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體均完整，并無受損。通過放大電鏡倍數(shù)，可以更加直觀的看到大鼠安靜狀態(tài)下，骨組織內(nèi)肌原纖維排列整齊，z線、H帶、界線清晰，組織內(nèi)各類細胞器均外膜完整，內(nèi)部的基質(zhì)均正常。(圖1)

圖1 對照組C(×26500倍)

大鼠在大負荷運動后即刻組E0(圖2)顯示大鼠骨骼肌內(nèi)肌原纖維排列不整齊，開始紊亂，z線開始扭曲，有溶解的趨勢，肌間隙開始增寬。通過放大電鏡倍數(shù)后，可以更加清晰的看到肌原纖維排列紊亂，z線扭曲，有的甚至發(fā)生溶解，H帶、I帶、M線都已經(jīng)消失，無法辨別，周圍的細胞器外層膜模糊不清，肌間隙增寬，并出現(xiàn)空泡化。力竭運動后24h(E24組)電鏡下顯示骨骼肌內(nèi)部改變，肌原纖維完全紊亂，處于扭曲的狀態(tài)，同時空泡化很嚴重，z線模糊，溶解。放大電鏡倍數(shù)顯示大鼠的肌原纖維紊亂，z線溶解，消失,周圍的細胞器空泡化增多。(圖3)

圖2 力竭即刻E0組(×25600倍) 圖3 力竭運動組E24組(×18500倍)

2.2 增殖細胞核抗原(PCNA)的表達

大負荷運動后大鼠骨骼肌內(nèi)增殖細胞核抗原PCNA含量變化，其中安靜組內(nèi)的PCNA含量很少，而在力竭運動組E12-E72組的增殖細胞核抗原含量均有顯著增加(P<0.05)，顯示此時大鼠內(nèi)由于損傷導致增殖細胞核抗原含量的增加，大鼠內(nèi)自體修復過程在E24達到峰值(P<0.01)。(表1，圖4)

表1 PCNA的Western Bolt 分析結(jié)果

圖4 大負荷運動以及恢復期各組大鼠骨骼肌中增殖細胞核抗原(PCNA)的變化

3 分析與討論

3.1 大負荷運動及恢復期間大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的改變

運動性骨骼肌微損傷是競技體育中常見問題，為了更加直觀的觀察與研究，目前多以動物活體實驗為主，探討骨骼肌微損傷直觀研究以及自體修復過程。 Newham[5]研究表明,肌肉牽拉練習后,可見肌節(jié)結(jié)構(gòu)破壞,細胞膜通透性增高,纖維變性,巨噬細胞浸潤等組織學改變。崔玉鵬[6]等研究大鼠不同負荷游泳運動后比目魚肌Z線變化的結(jié)果表明，肌纖維A帶拉長，H帶結(jié)構(gòu)不清楚，Z線流、Z線局灶性溶解、斷裂和消失，同時觀察到線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)等細胞器有不同程度的腫脹和擴張。金其貫[7]等讓大鼠進行200 min的下坡跑離心運動,1次離心運動后即刻,大鼠股四頭肌的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)肌原纖維排列不規(guī)則；局部Z線不規(guī)則,變細,肌絲排列混雜卷曲。離心運動后24 h,大鼠股四頭肌出現(xiàn)肌原纖維排列紊亂,扭曲,且具有輕度溶解、斷裂現(xiàn)象; Z線不規(guī)則,可見Z線流,呈鋸齒狀,局部Z線消失;T小管和肌漿網(wǎng)模糊不清。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，安靜對照組中的肌原纖維內(nèi)I/H帶、z線、細胞器等未發(fā)生改變，呈正常的超微結(jié)構(gòu)特征。力竭運動組中的E24組，出現(xiàn)I/H帶模糊、肌原纖維完全紊亂、處于扭曲的狀態(tài)、同時空泡化很嚴重、z線也紊亂、線粒體內(nèi)的嵴密集程度減少。本實驗與多數(shù)學者微損傷的研究結(jié)果相符，從力學角度來說，游泳運動模型相對于跑臺運動模型，骨骼肌的內(nèi)部機械損傷刺激緩和些，因此，電鏡下觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的破壞程度與跑臺模型相比輕微些。

3.2 大負荷運動及恢復期間增殖細胞核抗原的變化

Forrest[8]等研究認為大強度運動后，隨著自由基的增多，細胞抗氧化能力降低，膜脂質(zhì)被過氧化后，進一步攻擊位于核小體之間的組蛋白成分，導致堿基修飾、堿基丟失、單鏈和雙鏈DNA 的斷裂、DNA 交鏈而造成DNA 損傷，引起細胞凋亡，造成骨骼肌細胞的微損傷。顧榮瑞[9]等研究發(fā)現(xiàn)一次性力竭運動使大鼠股四頭肌紅肌自由基水平升高,從而導致股四頭肌紅肌生物膜的完整性喪失及損害,使肌肉工作能力下降而產(chǎn)生疲勞。增殖細胞核抗原(PCNA)可與蛋白因子結(jié)合參與細胞周期調(diào)控、DNA修復以及細胞凋亡等過程。由于其特殊的三聚體保守結(jié)構(gòu)，不僅參與DNA復制過程同時也可與各類蛋白相互作用，達到DNA修復作用。在DNA復制過程中，PCNA作為重要的調(diào)控者，協(xié)調(diào)各個步驟有序的進行，使得不同蛋白質(zhì)的結(jié)合和解離依次進行，從而確保了遺傳干細胞的迅速增殖時，將遺傳基因準確的正確的傳遞給子細胞。

Parrllla[10]和Friedrieh[11]研究發(fā)現(xiàn)PCNA參與DNA的修復過程的作用以及參與的途徑并不是單一的，已證明PCNA能夠與檢驗點蛋白Radg和Husl相互作用，而Radg，Husl與Radl形成一個稱為9-1-1環(huán)狀復合體，將多種修復相關(guān)蛋白引導到損傷部位，因此PCNA可能在這個復合體中協(xié)調(diào)細胞周期阻滯與DNA損傷修復兩個功能的轉(zhuǎn)換。本實驗結(jié)果顯示，力竭運動即刻和恢復12、24、48、72 小時大鼠骨骼肌PCNA表達與安靜對照組相比有顯著性差異，特別是在力竭運動的E24組表達最為明顯,表明7天力竭游泳運動導致大鼠骨骼肌出現(xiàn)微損傷，PCNA作為DNA的修復的參與者，發(fā)揮其特殊的生物學效應促進大鼠組織損傷修復。PCNA多作為醫(yī)學領(lǐng)域中與腫瘤、肺癌等癌癥疾病的分型、發(fā)展、分化程度有關(guān)，而將運動與PCNA的相關(guān)聯(lián)的報道很少，本實驗只是探討初期，仍需要進一步的探討。

4 結(jié)束語

7天力竭的大負荷訓練可引起一定的骨骼肌微損傷，在力竭訓練后以及恢復期間，大鼠骨骼肌中的增殖細胞核抗原(PCNA)明顯增加，提示PCNA與肌肉微損傷的自身修復有關(guān)。

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