張成 康鵬 陳紅娟

1 陜西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心 （西安 710075）

2 陜西瑞盛生物科技有限公司 （西安 710048）

骨誘導(dǎo)天然煅燒骨為源自牛骨的天然骨無(wú)機(jī)材料，按照嚴(yán)格的安全規(guī)范，經(jīng)過(guò)多級(jí)凈化工藝，從天然牛骨中提取出高純度的骨無(wú)機(jī)材料，再?gòu)?fù)合經(jīng)過(guò)多步驟純化的牛骨膠原，其具有高度的骨引導(dǎo)結(jié)構(gòu)及骨誘導(dǎo)活性。在臨床上主要用于填充骨缺損和骨擴(kuò)展，牙槽嵴的擴(kuò)展、重建，填充拔牙窩，骨腫瘤引起的非承重部位骨缺損填充，種植牙手術(shù)，制備種植床，上頜竇提升術(shù)，牙周治療，骨缺損的填充，引導(dǎo)組織再生術(shù)（GTR）等。按照醫(yī)療器械分類目錄，該產(chǎn)品為三類植入式醫(yī)療器械，其醫(yī)療器械分類編碼為6846，因此植入前須確保產(chǎn)品無(wú)菌。而該產(chǎn)品作為生物醫(yī)用材料，國(guó)家目前未對(duì)其無(wú)菌方法學(xué)驗(yàn)證做出具體的檢測(cè)要求，為了確保廣大人民群眾用械安全，我們對(duì)其無(wú)菌方法進(jìn)行驗(yàn)證。

由于無(wú)菌檢查時(shí)必須選擇適宜的方法消除其對(duì)培養(yǎng)基干擾，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為此我們按照《中國(guó)藥典》2010 年版三部（附錄ⅦA）無(wú)菌檢查法項(xiàng)下直接接種法的要求對(duì)骨誘導(dǎo)天然煅燒骨進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，對(duì)其無(wú)菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.儀器與材料

1.1 LMQ.R-4060 壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械臺(tái)式柜分廠）；GH-360ASB 型隔水式培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；JY-B210 型生化培養(yǎng)箱（上海虹浦儀器廠）。

1.2 骨誘導(dǎo)天然煅燒骨： 陜西瑞盛生物科技有限公司（規(guī)格：CBB-G1-C 批號(hào)：100901、100902、100903）。

1.3 菌株：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白 色 念 珠 菌 [CMCC(F)98001]、 黑 曲 霉[CMCC(F)98003]。以上菌株均由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供。

1.4 培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 批號(hào)100322、改良馬丁培養(yǎng)基 批號(hào)100202、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基批號(hào)100309、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)100106、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)100312。以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備： 接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35?C 培養(yǎng)24 小時(shí)；接種白色念珠菌至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，20～25?C 培養(yǎng)48 小時(shí)；接種黑曲霉菌至改良馬丁瓊脂斜面，23～28?C 培養(yǎng)7 天（用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫孢子，標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁）。以上培養(yǎng)物均用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成菌懸液。

2.2 菌液計(jì)數(shù)：每種菌液接種2 個(gè)平皿，取其平均值。取金黃色葡萄球菌液、銅綠假單胞菌液、枯草芽孢桿菌液各1ml，注入約15ml 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，30～35?C 培養(yǎng)，白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入約15ml 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20～25?C培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3 方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)組：取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基8 管，分別接種加入已制備好的金黃色葡萄球菌菌液、銅綠假單胞菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、生孢梭菌菌液各1ml，取每管裝量為9ml改良馬丁培養(yǎng)基4 管接種分別加入已制備好的白色念珠菌菌液、黑曲霉菌菌液各1ml；其中1 管加供試品規(guī)定量（約0.5g），所有培養(yǎng)基管置規(guī)定的溫度，培養(yǎng)3～5 天。如培養(yǎng)基各管24 小時(shí)內(nèi)微生物生長(zhǎng)良好，則供試品無(wú)抑菌作用。如加供試品的培養(yǎng)基管與未加供試品的培養(yǎng)基管對(duì)照比較，微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，均判為供試品有抑菌作用。該供試品需用稀釋法（種入較大量培養(yǎng)基中）或中和法、薄膜過(guò)濾法處理，消除供試品的抑菌性后，方可接種至培養(yǎng)基。

2.3.2 供試品對(duì)照組：取供試品21 支，以無(wú)菌操作將該供試品分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11 管，其中1 管接種金黃色葡萄球菌對(duì)照用菌液50～100cfu/mL 做為陽(yáng)性對(duì)照；另接種于改良馬丁培養(yǎng)基10 管，輕輕振搖使供試品與培養(yǎng)基混合，按規(guī)定條件培養(yǎng)14 天,逐日觀察。

2.3.3 陰性對(duì)照組：取硫乙醇鹽培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)14 天，逐日觀察。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌液計(jì)數(shù)：結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1 可知結(jié)果符合規(guī)定。

3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)各組生長(zhǎng)情況：結(jié)果見(jiàn)表2

由表2 可知各試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好。

表1. 陽(yáng)性對(duì)照菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表2. 無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

4.討論

經(jīng)過(guò)三次平行試驗(yàn)，與對(duì)照組比較，含供試品的各管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好,并與各對(duì)照組中相應(yīng)菌落生長(zhǎng)情況相似，供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組均無(wú)菌落生長(zhǎng)。由此說(shuō)明，骨誘導(dǎo)天然煅燒骨在此檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，因此可按此檢查法和檢查條件進(jìn)行骨誘導(dǎo)天然煅燒骨的無(wú)菌檢查。另外，制備生孢梭菌菌混懸液時(shí)，動(dòng)作要盡量輕，要將菌液加到氧化層下面，以免破壞氧化層環(huán)境；制備黑曲霉時(shí)，要關(guān)閉凈化工作臺(tái)風(fēng)機(jī)，或者在生物安全柜中操作。如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或滅活劑等方法來(lái)消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì) 中華人民共和國(guó)藥典 三部.北京;化學(xué)工業(yè)出版社,2010,附錄ⅦA.