仲維莉，鄒國(guó)良，張錦

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管一病區(qū)，哈爾濱150040；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001）

L?arginine對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用

仲維莉1，3，鄒國(guó)良2，張錦3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管一病區(qū)，哈爾濱150040；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001）

目的觀察不同濃度的L-arginine對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）衰老的作用。方法HUVECs分別培養(yǎng)在正常糖濃度組（5.5 mmol/L）、高糖組（33 mmol/L）及高糖+不同濃度L-arginine（0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L）組，SA β-gal活性評(píng)定細(xì)胞衰老的程度，PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ROS及細(xì)胞周期，ELISA檢測(cè)NO水平。結(jié)果與正常糖濃度組比較，高糖組SA β-gal活性增強(qiáng)（P＜0.01），G0/G1期細(xì)胞比率增加（P＜0.01），端粒酶活性減弱（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS增多（P＜0.01），而NO水平減少（P＜0.001）。高糖環(huán)境下0.4～1.6 mmol/L的L-arginine均可抑制SA β-gal活性（P＜0.01），減少G0/G1期細(xì)胞比率（P＜0.01），增強(qiáng)端粒酶活性（P＜0.01），減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成（P＜0.01），增加NO水平（P＜0.01）。結(jié)論高糖可以誘導(dǎo)HUVECs的衰老。L-arginine可以延緩高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程，但并沒有明顯的劑量依賴性。L-arginine可通過增強(qiáng)端粒酶活性，減少氧化應(yīng)激，增加NO水平發(fā)揮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。

高糖；內(nèi)皮細(xì)胞；衰老；L-arginine；端粒酶；氧化應(yīng)激

衰老所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化早期的病理生理學(xué)變化［1］，高血糖是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，有研究表明高糖可以加速細(xì)胞的衰老，因此，研究高血糖、衰老、動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系是防治糖尿病大血管病變、研發(fā)有效抗衰老抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)擬解決的主要問題是L-arginine是否可以延緩高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程，這種抗衰老的作用是否具有劑量依賴性，為防治大血管病變藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），D-glucose、碘化丙錠（propidium iodide，PI，美國(guó)Sigma公司），細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase，SA β-gal）染色試劑盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、總一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物試劑公司）；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Roche Diagnostics公司）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)THERMO HERAcell-150），倒置相差熒光顯微鏡（日本Olympus IX71），全自動(dòng)流式細(xì)胞儀（美國(guó)FACSCalibur BD），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)BD公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Model 680，BIORAD），細(xì)胞周期數(shù)據(jù)分析用BD公司提供的Moldifit 2.0軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：常規(guī)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）培養(yǎng)：正常糖濃度組（5.5 mmol/L D-glucose）、高糖組（33 mmol/ L D-glucose）、0.4 mmol/L L-arginine組（33 mmol/L D-glucose+0.4 mmol/L L-arginine）、0.8 mmol/L L-arginine組（33 mmol/L D-glucose+0.8 mmol/L L-arginine）、1.6 mmol/L L-arginine組（33 mmol/L D-glucose+1.6 mmol/L L-arginine）、3.2 mmol/L L-arginine組（33 mmol/L D-glucose+3.2 mmol/L

L-arginine），作用于HUVECs 48 h，觀察各指標(biāo)的變化，了解L-arginine的量效性。

1.3.2 SA β-gal染色鑒定細(xì)胞衰老程度：按照SA βgal染色試劑盒操作步驟，將HUVECs處理及染色，鑒定SA β-gal活性。SA β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比作為衰老程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定每1 000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞（藍(lán)綠色細(xì)胞）的百分比。

1.3.3 細(xì)胞端粒酶的活性：采用Telo TAGGG telomerase PCR ELISA試劑盒測(cè)定，細(xì)胞提取物經(jīng)過端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增、變性、雜交及ELISA過程，按公式測(cè)出端粒酶的相對(duì)活性。

1.3.4 細(xì)胞周期分析：收集1×106個(gè)細(xì)胞，于低溫離心機(jī)300 g離心5 min，PBS清洗2次，緩慢加入70%的冰凍乙醇，吹散混勻細(xì)胞，4℃固定過夜；300 g離心5 min棄去乙醇，冷PBS清洗細(xì)胞2次；加入終濃度為50 μg/mL PI染液，4℃避光反應(yīng)60 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，數(shù)據(jù)用BD公司提供的Moldifit2.0分析，獲取10 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞流速不超過60/min。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平：細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為2×106/mL；用無血清DMEM按照1∶1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L；將收集的細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻；用無血清的DMEM洗滌細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，獲取1 000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)總NO水平：總NO檢測(cè)試劑盒是采用了硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽，從而檢測(cè)出所有的硝酸鹽及亞硝酸鹽的量，從而推算出總NO的量。按照試劑盒操作步驟處理，540 nm測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣本中NO的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs SA β-gal染色的影響

L-arginine（0.4、0.8、1.6 mmol/L）作用于HUVECs 48 h，與高糖組相比，SA β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.001），以0.8 mmol/L效果最佳（P＜0.01）。而3.2 mmol/L L-arginine組SA β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)與高糖組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs端粒酶活性的影響

L-arginine（0.4、0.8、1.6 mmol/L）作用于HUVECs 48 h，與高糖組相比，端粒酶活性明顯增強(qiáng)（P＜0.01），以0.8 mmol/L效果最佳（P＜0.01），3.2 mmol/L L-arginine組端粒酶活性與高糖組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs細(xì)胞周期的影響

L-arginine（0.4、0.8、1.6 mmol/L）作用于HUVECs 48 h，與高糖組比較，G0/G1期細(xì)胞比例降低（P＜0.01），S期細(xì)胞比例明顯增多（P＜0.01）。3.2 mmol/L L-arginine組各期細(xì)胞比例與高糖組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs內(nèi)ROS水平的影響

圖1 高糖環(huán)境下L?arginine對(duì)HUVECs SA β?gal染色的影響Fig.1 Effect of L?arginine on SA β?gal staining in HUVECs under high glucose condition

圖2 不同濃度的L?arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs端粒酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentration of L?arginine on telomerase activity in HUVECs under high glucose condition

圖3 高糖環(huán)境下L?arginine對(duì)HUVECs細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of L?arginine on cell cycle in HUVECs under high glucose condition

L-arginine（0.4、0.8、1.6 mmol/L）作用于HUVECs 48 h，與高糖組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS明顯降低（P＜0.01），以0.8 mmol/L作用最佳（P＜0.01）。3.2 mmol/L L-arginine組ROS水平與高糖組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如圖4所示。

2.5 L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs內(nèi)總NO水平的影響

L-arginine（0.4、0.8、1.6 mmol/L）作用于HUVECs 48 h，與高糖組比較，細(xì)胞內(nèi)總NO水平明顯升高（P＜0.01），以0.8 mmol/L作用最明顯（P＜0.01）。3.2 mmol/L L-arginine組細(xì)胞內(nèi)總NO水平與高糖組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 不同濃度的L?arginine對(duì)高糖環(huán)境HUVECs內(nèi)ROS水平的影響Fig.4 Effect of different concentration of L?arginine on ROS level in HUVECs under high glucose condition

圖5 不同濃度的L?arginine對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs內(nèi)NO水平的影響Fig.5 Effect of different concentration of L?arginine on NO level in HUVECs under high glucose condition

3 討論

目前，關(guān)于糖尿病大血管病變的防治方法仍然僅限于對(duì)危險(xiǎn)因素的控制，還沒有特異性藥物來防治它的發(fā)生發(fā)展。近年來一些研究已經(jīng)顯示內(nèi)皮細(xì)胞的衰老、凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此抗衰老藥物的研發(fā)將成為防治大血管病變的新途徑。目前研究顯示可以改善內(nèi)皮功能、抗細(xì)胞衰老的藥物主要有L-arginine、抗氧化劑（維生素C、維生素E等）、他汀類藥物、α-亞麻酸、α-硫辛酸、二甲雙胍、ACEI類等藥物。

L-arginine是目前的抗細(xì)胞衰老藥物之一，它是內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的作用底物，是合成NO的前體物質(zhì)。它對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、紅細(xì)胞等均有保護(hù)作用，但L-arginine改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制尚未完全闡釋清楚。目前最為認(rèn)可的機(jī)制是L-arginine通過增強(qiáng)eNOS蛋白的表達(dá)，增加NO的合成、減少氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮的。但是關(guān)于補(bǔ)充L-arginine對(duì)抗衰老的利弊仍然存在著爭(zhēng)議。一些研究表明補(bǔ)充L-arginine可以活化eNOS，增加NO的合成，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能［2～4］；65歲以上人群給予補(bǔ)充高劑量L-arginine可以明顯改善腦白質(zhì)疏松癥患病率較高患者的認(rèn)知功能和步態(tài)障礙［5］；L-arginine可以減輕心肌病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善血壓［6］。Scalera等［7］研究顯示L-arginine可以延緩ADMA及同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程，其機(jī)制可能與增加eNOS蛋白表達(dá)和NO的合成有關(guān)。但Suschek等［8］研究指出L-arginine可以通過活化誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iN0S）而產(chǎn)生過多的NO并抑制過氧化氫，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能為高水平的L-arginine可以促進(jìn)內(nèi)皮陽性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)及活化，從而誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生過量的NO所致。而Scalera等［9］在其新近的研究中又指出長(zhǎng)期持續(xù)高劑量的L-arginine刺激將加速內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，其機(jī)制可能與精氨酸酶Ⅱ翻譯及翻譯后的激活有關(guān)。因此，深入研究明確L-arginine對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用及機(jī)制，對(duì)改善內(nèi)皮功能障礙、對(duì)抗細(xì)胞衰老尤為重要。

本研究中，我們根據(jù)以往的相關(guān)研究選取了4個(gè)濃度的L-arginine作為研究對(duì)象，這4個(gè)濃度在各自的實(shí)驗(yàn)中都認(rèn)為對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.4～1.6 mmol/L的L-arginine均具有良好的抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老作用，如明顯減少SA β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），減少了G0/ G1期細(xì)胞比例（P＜0.01），增強(qiáng)了端粒酶的活性（P＜0.01），同時(shí)也減輕了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，增加了NO水平，降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。而3.2 mmol/L的L-arginine卻沒有這種抗細(xì)胞衰老的作用，其各項(xiàng)觀察指標(biāo)與33 mmol/L高糖組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這似乎提示我們高濃度的L-arginine對(duì)高糖環(huán)境下的內(nèi)皮細(xì)胞并沒有保護(hù)作用，甚至可能具有加速細(xì)胞衰老的作用，當(dāng)然這需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

值得我們注意的是，雖然1.6 mmol/L的L-argi-nine也具有良好的抗細(xì)胞衰老作用，其效果優(yōu)于0.4 mmol/L的L-arginine（P＜0.01），但與0.8 mmol/L的L-arginine比較，其抗衰老作用有所減退，表現(xiàn)在各觀察指標(biāo)二者的差異均有顯著性（P＜0.05），這可能與選取濃度跨度過大有關(guān)，亦有可能是當(dāng)L-arginine上升到一定濃度后便不具有抗衰老作用或存在負(fù)面作用，因此，L-arginine有效濃度的篩選仍需更進(jìn)一步深入研究，以確定最安全有效的藥物濃度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L-arginine可以延緩高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，但并不能完全逆轉(zhuǎn)，這種保護(hù)作用可能與減少氧化應(yīng)激損傷、增強(qiáng)端粒酶活性有關(guān)，我們推斷它通過增加NO合成，減少ROS生成，減少氧化應(yīng)激損傷，延緩細(xì)胞衰老；同時(shí)增強(qiáng)端粒酶活性，使其發(fā)揮延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度、調(diào)節(jié)端粒功能的作用，從而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，這正符合目前關(guān)于衰老的機(jī)制學(xué)說中最具代表性亦被廣大學(xué)者所公認(rèn)的兩大學(xué)說，即端粒學(xué)說及氧化應(yīng)激學(xué)說，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討L-arginine抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。

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（編輯 裘孝琦）

L-arginine Attenuates High Glucose Induced EndothelialCellSenescence

ZHONG Wei-li1，3，ZOU Guo-liang2，ZHANG Jin3
（1.Department of Endocrinology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Department of Cardiology，F(xiàn)irst Affiliated HospitalofHeilongjiang University ofChinese Medicine，Harbin 150040，China；3.DepartmentofEndocrinology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo observe effect of L-arginine on high glucose-induced senescence in human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.MethodsHUVECs were divided into 3 groups and respectively cultured undernormalglucose（5.5 mmol/L），high glucose（33 mmol/L），co-incubation with high glucose and L-arginine（0.4，0.8，1.6，3.2 mmol/L）.β-gal activity was assessed to determine the cellular senescence；PCR-ELISA was used to detecttelomerase activity，ROS and cellcycle wasmeasured by flow cytometry；NO levelwasmeasured by ELISA.ResultsUnderhighglucose condition，SA β-gal activity was enhanced（P＜0.01），telomerase activity was decreased（P＜0.01），percentage of G0/G1phase cells was increased（P＜0.01），intracellular ROS was increased（P＜0.01），while the NO levels was decreased（P＜0.001）.0.4-0.6 mmol/L of L-arginine inhibited SA β-gal activity（P＜0.01），enhanced telomerase activity（P＜0.01），reduced the G0/G1phase cell percentage（P＜0.01），reduced the ROS level（P＜0.01），while increased NO levels（P＜0.01）.ConclusionHigh glucose can induce endothelial cell senescence.L-arginine can significantly delay the high glucose-induced endothelial cell aging process，but no significant dose-dependent manner was observed.L-arginine can play a role in anti-endothelialcellsenescence through enhancing telomerase activity，reducing oxidative stress and increasing NOlevel.

high glucose；endothelial cell；senescence；L-arginine；telomerase；oxidative stress

R587.1

A

0258-4646（2014）06-0533-05

黑龍江省博士后資助基金（LRB11-365）；黑龍江省自然科學(xué)基金（h201325）

仲維莉（1980-），女，主治醫(yī)師，博士.

張錦，E-mail：zhangjininsy@gmail.com

2014-03-11

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