胡軍，趙淵源，孫靖涵，侯志文，于波

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽110001）

胡黃連苷Ⅱ?qū)σ掖颊T導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

胡軍，趙淵源，孫靖涵，侯志文，于波

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽110001）

目的探討胡黃連苷Ⅱ?qū)σ掖妓翲9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法用MTT檢測細(xì)胞存活率，LDH、SOD、Gpx、MDA及ROS試劑盒檢測H9C2細(xì)胞在乙醇干預(yù)及胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理條件下的氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果100 mmol/L及以上濃度的乙醇可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞的存活率下降，100～200 mmol/L之間細(xì)胞存活率下降最為明顯，200 mmol/L的乙醇可導(dǎo)致上清液中LDH活性的增加、細(xì)胞勻漿中SOD及Gpx活性的下降、細(xì)胞勻漿中MDA及細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加。而胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理可部分改善乙醇所致細(xì)胞存活率的下降，其保護(hù)作用部分是通過提高細(xì)胞中SOD及Gpx活性實現(xiàn)的。結(jié)論胡黃連苷Ⅱ?qū)σ掖妓翲9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用部分是通過提高細(xì)胞的抗氧化作用實現(xiàn)的。

胡黃連苷Ⅱ；H9C2心肌細(xì)胞；乙醇；氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激在包括酒精性心肌病在內(nèi)的許多心血管疾病中起重要作用［1，2］。氧化應(yīng)激以活性氧的產(chǎn)生與清除失衡為特點(diǎn)?；钚匝醯那宄到y(tǒng)包括酶途經(jīng)和非酶途經(jīng)，前者包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，后者包括維生素C、維生素E等?；钚匝踔饕ǔ蹶庪x子、過氧化氫、羥自由基，它們可以通過氧化蛋白、脂類、核酸而影響細(xì)胞的完整性，從而影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，另一方面活性氧也可以啟動細(xì)胞的凋亡途經(jīng)。有研究報道，抗氧化治療能夠通過激活抗氧化酶系統(tǒng)，增強(qiáng)細(xì)胞對活性氧的清除能力，從而在乙醇誘導(dǎo)的損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［3］。

胡黃連苷Ⅱ是一種從胡黃連中分離的環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，曾有研究顯示胡黃連苷Ⅱ有多種藥理學(xué)作用，對心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟等均具有保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在抗凋亡、抗缺血、抗炎等方面。近期的研究顯示胡黃連苷Ⅱ在缺氧復(fù)氧所致的心肌氧化應(yīng)激損傷中有抗氧化作用［4］。然而，胡黃連苷Ⅱ在乙醇所誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的損傷中是否能發(fā)揮保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究擬探討胡黃連苷Ⅱ在乙醇所致的H9C2心肌細(xì)胞的損傷中的作用并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

H9C2心肌細(xì)胞購自北京鼎國昌盛生物有限公司。胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌焚徸灾袊幤飞镏破窓z定所；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽氧化酶（glutathione peroxidase，Gpx）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司；其他常規(guī)試劑均購自北京鼎國昌盛生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 mg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時進(jìn)行傳代。將細(xì)胞接種于96孔板中（1×104～1.5×104/孔），用MTT法檢測細(xì)胞存活率。將細(xì)胞接種于6孔板中（2×105～3×105/孔），用于檢測SOD、LDH、Gpx及MDA，用倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種至96孔板（1×104～1.5×104/孔，37℃培養(yǎng)24 h后，分別以0、0.32、1.6、8、40、200及1 000 mg/L胡黃連苷Ⅱ處理48 h，或者以0、50、100、200、400及800 mmol/L乙醇處理24 h。處理完畢的細(xì)胞每孔加入5 mg/mL MTT 15 μL，繼續(xù)孵育4 h后，棄培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（150 μL/孔），置搖床上搖晃10 min。酶標(biāo)儀測490 nm吸光值，計算細(xì)胞的存活率。

1.2.3 乙醇及胡黃連苷Ⅱ濃度的選擇：以不同濃度乙醇（25～800 mmol/L）處理細(xì)胞24 h，檢測細(xì)胞存活率，制作濃度生存率曲線，根據(jù)該曲線選擇后續(xù)實驗乙醇作用濃度；以不同濃度胡黃連苷Ⅱ（0.32～1 000 mg/L）預(yù)處理細(xì)胞24 h，之后以上述所選擇的乙醇濃度處理24 h，檢測細(xì)胞存活率，制作生存率曲線，根據(jù)該結(jié)果進(jìn)行實驗分組。

1.2.4 實驗分組：（1）對照組（control組）：以不含乙醇的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)液；（2）乙醇組（alcohol組）：以不含乙醇的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，將培養(yǎng)液置換為含200 mmol/L乙醇的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液；（3）～（5）胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理組（picrosideⅡ1組）：分別以含8、40、200 mg/L胡黃連苷Ⅱ的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，置換培養(yǎng)液為含200 mmol/L乙醇的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液。

1.2.5 LDH測定：收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液上清20 μL，按照LDH檢測試劑盒說明書檢測上清液中LDH的含量。

1.2.6 SOD、Gpx、MDA的測定：收集處理完畢的細(xì)胞，采用超聲破碎儀碎裂細(xì)胞，用BCA定量試劑盒檢測細(xì)胞勻漿的總蛋白含量，按照SOD、Gpx、MDA檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定操作，計算各自的含量。

1.2.7 ROS的測定：采用ROS測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。用PBS清洗處理完畢的細(xì)胞，用含0.1%cDCFH-DA的無血清培養(yǎng)基孵育30 min，采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，剛接種的心肌細(xì)胞呈球形，24 h后，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁、逐漸擴(kuò)展，呈類三角形或不規(guī)則的星形，細(xì)胞伸出偽足，并相互交接成網(wǎng)；乙醇組細(xì)胞形態(tài)不一，漂浮細(xì)胞較多（圖1）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果Fig.1 Cell morphology of different groups

2.2 細(xì)胞存活率

MTT結(jié)果顯示：不同濃度胡黃連苷Ⅱ（0.32～1 000 mg/L）處理細(xì)胞48 h對細(xì)胞的存活率無明顯影響；乙醇以濃度依賴的方式導(dǎo)致細(xì)胞的存活率下降，乙醇濃度≥100 mmol/L時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），200 mmol/L時細(xì)胞存活率下降更為明顯，故后續(xù)實驗以200 mmol/L作為損傷條件；另一方面，胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞24 h可以濃度依賴的方式提高乙醇所致的細(xì)胞存活率的下降，從8 mg/L開始差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016），1 000 mg/L與200 mg/L時比較，生存率未明顯增強(qiáng)，故后續(xù)實驗以8、40、200 mg/L來研究胡黃連苷Ⅱ的保護(hù)作用（圖2）。

2.3 LDH檢測結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH的含量作為評價細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，檢測結(jié)果顯示：胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞24 h可以濃度依賴的方式降低乙醇所致的培養(yǎng)液上清液中LDH的升高（表1）。

2.4 MDA檢測結(jié)果

MDA作為反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，正常組織中含量極低。檢測結(jié)果顯示：200 mmol/L乙醇可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量的升高，而胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞24 h可以濃度依賴的方式降低乙醇所導(dǎo)致的MDA的升高（表1）。

2.5 SOD及Gpx檢測結(jié)果

SOD及Gpx作為細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)主要的酶，其活性代表著細(xì)胞的抗氧化能力。檢測結(jié)果顯示：200 mmol/L乙醇可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD及Gpx活性的降低，而胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞24 h可以濃度依賴的方式提高乙醇所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)SOD及GSH-Px活性的降低（表1）。

2.6 ROS檢測結(jié)果

圖2 細(xì)胞存活率MTT檢測結(jié)果Fig.2 Results of MTT cell viability

細(xì)胞內(nèi)ROS的含量可以cDCF的熒光強(qiáng)度表示，倒置熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示：200 mmol/L乙醇可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，而胡黃連苷Ⅱ預(yù)處理細(xì)胞24 h可以濃度依賴的方式降低乙醇所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加（圖3）。

表1 各組細(xì)胞LDH、Gpx、SOD活性及MDA含量比較（n=6）Tab.1 Effect on LDH，Gpx，SOD activities and MDA content in H9C2 cardiomyocytes subjected to alcohol injury of each group（n=6）

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和消除失衡，或外源性氧化物質(zhì)過量攝入，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)過量蓄積。ROS包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、氧自由基等，是生物體內(nèi)活性含氧化合物的總稱，過量蓄積可引起細(xì)胞毒性改變的病理過程。生理條件下，組織正常的氧化代謝會生成少量的ROS，能夠被細(xì)胞的抗氧化防御體系快速清除，從而維持體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。但在病理條件及某些損傷因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物增加，超過細(xì)胞抗氧化體系能夠承受的范圍，則發(fā)生氧化損傷。該過程在心肌缺血、心肌再灌注及酒精性心肌病等病變中都起著重要作用［4，5］。大量氧自由基的產(chǎn)生，可造成生物膜脂質(zhì)過氧化、各種酶蛋白失活及DNA損傷。氧自由基通過攻擊奪獲生物膜脂質(zhì)多聚不飽和脂肪酸側(cè)鏈上的氫原子等過程，造成膜流動性與鈣離子通透性增加，破壞膜結(jié)構(gòu)完整性，鈣跨膜內(nèi)流與超負(fù)荷，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。乙醇可通過上調(diào)豐富蛋白酪氨酸激酶（protein-rich tyrosine kinase-2，PYK2）下調(diào)caveolin-1促使ROS的產(chǎn)生。也有研究表明慢性乙醇攝入可誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)增加，CYP2E1的高表達(dá)又可致超氧陰離子等氧化應(yīng)激指標(biāo)增加，而通過抑制CYP2E1的高表達(dá)可減輕乙醇誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞功能障礙及凋亡［1，2，6，7］。Zhang等［8］和Antonenkov等［9］的研究表明氧化應(yīng)激損傷在酒精性心肌病的啟動及進(jìn)展中起關(guān)鍵性作用。

圖3 胡黃連苷Ⅱ?qū)σ掖颊T導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷ROS含量的影響Fig.3 Effects of picroside II on ROS in H9C2 cardiomyocytes subjected to alcohol

胡黃連的主要生物活性成分是環(huán)烯醚萜苷，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡的作用，其中胡黃連苷Ⅱ為其主要有效成分。研究表明，胡黃連苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)作用是通過清除氧自由基及增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的功能實現(xiàn)的。近期的研究表明，胡黃連苷Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護(hù)作用，提示胡黃連苷Ⅱ具有抗氧化、抗凋亡的作用，另外胡黃連苷Ⅱ在外周組織如腎臟、肝臟中也具有保護(hù)作用［10～12］。但其在酒精性心肌病中的作用未見報道。

檢測上清液中LDH活性可以評估心肌細(xì)胞受損傷的嚴(yán)重程度。氧化應(yīng)激時，不僅ROS生成增多，機(jī)體對ROS的清除能力也顯著降低，從而造成ROS大量蓄積，引起嚴(yán)重的氧化損傷。MDA是ROS與細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸反應(yīng)生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量能夠反映脂質(zhì)過氧化損傷狀態(tài)，間接地反映機(jī)體受ROS攻擊的嚴(yán)重程度。SOD、Gpx作為體內(nèi)主要的抗氧化酶，其活性也體現(xiàn)了細(xì)胞的抗氧化能力。本研究結(jié)果顯示：乙醇可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，其中包括上清液中LDH升高，細(xì)胞內(nèi)MDA及ROS升高，以及細(xì)胞內(nèi)SOD、Gpx降低；而胡黃連苷Ⅱ可以濃度依賴的方式改善細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量及增加細(xì)胞的抗氧化能力。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討胡黃連苷Ⅱ?qū)凭孕募〔〉谋Ｗo(hù)作用機(jī)制提供了一定的方向。

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（編輯 王又冬）

Protective Effectof PicrosideⅡagainstAlcohol-induced Injury in H9C2 Cardiomyocytes

HU Jun，ZHAOYuan-yuan，SUNJing-han，HOUZhi-wen，YUBo
（DepartmentofCardiology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the cardioprotective role ofpicrosideⅡagainstalcohol-induced injury in H9C2 cardiomyocytes.MethodsThe cellviability and cellulardamage ofcardiomyocyteswere respectively assessed by MTTand LDH assays.The activities ofSODand Gpx，and the contents of MDA were determined using detection kit.The levels of ROS were evaluated by inverted fluorescence microscope.ResultsH9C2 cell viability wasdecreased when treated with alcoholabove 100 mmol/L，and the mostsignificantdecline was observed between 100-200 mmol./L Pretreatment of H9C2 cardiomyocytes with picrosideⅡ（8-200 mg/L）inhibited LDH activity in culture media and increased cell viability in a dose-dependentmanner.This protective effectwas accompanied by significantly increased activities ofSOD and GSH-Px，which attenuating MDAin response to alcohol-induced injury.Furthermore，picrosideⅡalso inhibited ROS production in H9C2 cardiomyocytes.ConclusionThe present study demonstrated that picrosideⅡprotects H9C2 cardiomyocytes against alcohol-induced injury through reduction of ROS production and enhancement of the activity ofantioxidantdefense.

picrosideⅡ；H9C2 cardiomyocytes；alcohol；oxidative stress

R542.2

A

0258-4646（2014）06-0523-05

遼寧省科技廳計劃項目（2012225084）

胡軍（1987-），男，碩士研究生.

于波，E-mail：ybdy@hotmail.com

2014-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版時間：