李響，韓圣，秦曉飛，吳安華

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

不同級別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的區(qū)別與聯(lián)系

李響，韓圣，秦曉飛，吳安華

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

目的探討不同級別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）表達的關系。方法2013年1月至2013年12月在我院進行神經(jīng)外科手術切除的98例腦膠質(zhì)瘤組織作為研究對象，采用免疫組織化學的方法分析不同級別膠質(zhì)瘤組織中P53蛋白與MGMT表達的關系。結(jié)果在不同級別膠質(zhì)瘤組織間，MGMT陽性表達無統(tǒng)計學差異（P=0.462），但表達強度差異明顯（P=0.019）。MGMT表達強度與腫瘤分級呈負相關（r=-0.629，P＜0.05）。MGMT與P53在陽性表達強度上呈負相關（r=-0.750，P＜0.05）。結(jié)論P53蛋白與MGMT在不同級別的膠質(zhì)瘤中的表達有一定的關系，而且P53表達增強和MGMT表達減弱均會對膠質(zhì)瘤的發(fā)生及其惡性程度產(chǎn)生影響。

膠質(zhì)瘤；P53蛋白；O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層細胞，是原發(fā)性腦腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤。目前臨床上膠質(zhì)瘤治療主要是手術治療，術后輔以放療和化療的綜合治療方式，但總體治療效果不理想，患者預后非常差，生存期約（12±3）個月。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）［1］是一種由MGMT基因編碼的DNA修復蛋白，它能將DNA鳥嘌呤6號氧上的烷基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，使DNA上烷基化的鳥嘌呤被還原，而自身則成為失活的烷基化MGMT。所以MGMT在機體正常細胞中具體保護作用，能夠使可致突變毒性和細胞毒性的烷基化合物所致?lián)p傷修復，避免烷化基團對細胞的損害，而這也是腫瘤耐受烷化劑類化療藥物的主要原因之一。P53作為體內(nèi)最重要的抑癌基因之一，在人類癌癥中發(fā)生突變的頻率高達50%，所形成的突變體P53不但失去了野生型P53的抑癌功能，而且還獲得了一系列類似于癌基因的功能，促進了腫瘤的進程。抑癌基因P53能使參與調(diào)控的細胞出現(xiàn)凋亡或負增長的情況，并能夠?qū)毎膼鹤儺a(chǎn)生抑制作用，但是由于P53蛋白半衰期較短，所以很難檢測。若P53基因出現(xiàn)缺失或突變情況，表達的P53蛋白半衰期明顯延長，所以突變型P53基因表達的蛋白能在多種腫瘤組織中檢測到。為了進一步揭示膠質(zhì)瘤的分子學特性，為膠質(zhì)瘤的治療方法的探尋和治療結(jié)果的改善提供更多的理論基礎，我們選取2013年1月至2013年12月在我院進行神經(jīng)外科手術切除的98例患者腦膠質(zhì)瘤組織作為研究對象，研究不同級別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與MGMT表達的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月至2013年12月在我院神經(jīng)外科手術切除患者腦膠質(zhì)瘤組織98例，所有患者均為初次手術，復發(fā)膠質(zhì)瘤患者未入組。其中男53例，女45例，年齡13～77歲，平均（38.2±2.5）歲。膠質(zhì)瘤的組織學診斷根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準，膠質(zhì)瘤Ⅰ級5例，Ⅱ級42例，Ⅲ級22例，Ⅳ級29例。

1.2 試劑

P53屬于即用型的單克隆鼠抗人抗體，試劑盒與液體DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新公司，MGMT診斷試劑盒購自四川宇康生物技術有限公司。

1.3 方法

P53蛋白檢測選擇Envision兩步法，MGMT操作過程參考試劑盒說明，Envision兩步法操作如下：脫蠟，然后乙醇梯度水化，把構(gòu)椽酸鈉緩沖液（pH6.0）按照0.01 mol/L加入，12 min微波爐抗原修復，微波爐溫度控制在92～98℃，處理完冷卻后，用PBST漂洗，然后通過加專用封閉液，在37℃的環(huán)境下，用10 min孵化，完成后將封閉液脫去，加入單抗，在37℃孵育60 min，3次漂洗PBST，加二抗然后在37℃孵育30 min，漂洗PBST，進行酶復合物添加，在37℃下進行30 min的孵育，漂洗PBST。司底物液加入量為1 mg/mL，顯色15 min，顯色停止選用蒸餾水［2］，復染蘇木精，用封片劑進行封片。

1.4 結(jié)果判斷

P53及MGMT陽性表達染色均定位于細胞核，陽性細胞表現(xiàn)為棕黃色顆粒。在40倍顯微鏡觀察細胞核染色數(shù)并計分：0分，陽性細胞數(shù)0～1%；1分，陽性細胞數(shù)1～10%；2分，陽性細胞數(shù)10%～25%；3分，陽性細胞數(shù)25%～50%；4分，陽性細胞數(shù)＞50%。細胞核染色程度：1為弱染色，淡黃色；2為中度染色，黃色；3為重度染色，黃褐色。兩項乘積得分分為5類等級：0分陰性（-），1～2分弱陽性或可疑陽性（+-），3～4分陽性（+），6分中等陽性（++），≥8分強陽性（+++）［3］。

1.5 統(tǒng)計學處理

運用Spearman等級相關檢驗MGMT染色強度、腫瘤分級的相關性，雙變量相關探討MGMT與P53表達強度的關系。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P53蛋白與MGMT的表達

P53蛋白與MGMT的表達均位于細胞核內(nèi)，P53蛋白表達細胞多分散分布，更傾向血管周細胞核染色。表達強度隨著腫瘤的惡性程度增加而增強，低分化膠質(zhì)瘤中分布更廣，強度更高（圖1）。P53蛋白的陽性表達率為53.1%。MGMT陽性細胞為棕黃色顆粒，分布不均勻，呈散在或灶性分布。不同腫瘤級別、不同標本的差異較大；腫瘤分級高者與分級低者比較染色強度較弱，細胞核數(shù)較少（圖2）。MGMT陽性表達率為90.8%。

圖1 膠質(zhì)瘤組織MGMT蛋白免疫組織化學染色結(jié)果×40Fig.1 Immunohistochemical staining result of MGMT in glioma tissue×40

圖2 膠質(zhì)瘤組織P53蛋白免疫組織化學染色結(jié)果×40Fig.2 Immunohistochemical staining result of P53 protein in glioma tissue×40

2.2 MGMT表達與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關系

MGMT在不同級別膠質(zhì)瘤的陽性表達率無統(tǒng)計學差異（P=0.462），但表達強度有統(tǒng)計學差異（P= 0.019），見表1。MGMT表達強度與腫瘤分級呈負相關（r=-0.629，P＜0.05）。

2.3 P53表達與MGMT表達間的關系

本組膠質(zhì)瘤中MGMT和P53蛋白陽性表達一致的符合率為40.8%（40/98），MGMT表達陽性組中隨其表達強度增高P53的表達強度明顯降低，兩者的表達強度呈明顯負相關（r=-0.750，P＜0.05），見表2。

表1 98例膠質(zhì)瘤組織MGMT的表達Tab.1 Expression of MGMT in 98 cases of glioma

表2 98例膠質(zhì)瘤組織中MGMT與P53蛋白表達強度比較Tab.2 Expression intensity of MGMT and P53 protein in 98 cases of glioma

3 討論

膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生可能由人腦基因突變引發(fā)，也有可能是蛋白功能失調(diào)的原因。造成各種抑癌基因失活的一個因素是啟動子區(qū)內(nèi)甲基化，進而引發(fā)腫瘤。能夠保護DNA異常甲基化的是MGMT，它能夠避免烷化劑損傷正常組織，降低癌癥出現(xiàn)頻次，然而，它也存在一些不良反應，抵消了烷化劑類化療藥物的藥效。

研究表明，MGMT與P53蛋白表達上兩者呈負相關，也就是說當MGMT表達明顯的時候，P53蛋白表達較弱。這可能是因為P53基因中的DNA被MGMT的高度活性保護所致，使得基因發(fā)生突變時能夠及時得到阻止［4］。與之相反MGMT啟動子高度甲基化的個體，MGMT就不能夠充分顯示其保護能力，也就增加了P53基因突變的可能性，使細胞中突變型P53蛋白表達增加，在一定程度上強化了免疫組化的表達。野生型P53能使參與調(diào)控的細胞出現(xiàn)凋亡或負增長的情況，并能夠?qū)毎膼鹤儺a(chǎn)生抑制作用，但是由于它的半衰期較短，所以免疫組化方法很難檢測出陽性結(jié)果［5］。若P53基因出現(xiàn)缺失或突變情況，其P53蛋白的表達特別顯著，而且半衰期也明顯延長，所以P53蛋白在多種腫瘤組織中都能檢測到［6］。對于MGMT和P53表達的關系問題，本研究只是初步進行，還需要更深入研究論證。

一般低度惡性膠質(zhì)瘤的范圍在Ⅰ～Ⅱ級，高度惡性膠質(zhì)瘤是Ⅲ～Ⅳ級。P53蛋白陽性表達率、表達強度與這些腫瘤分級相關（P＜0.05），而且是正比例的關系，也就是腫瘤惡性程度較高的情況下，其P53表達顯著增強［7］。這也反向證明了P53表達強度較高的腫瘤，具有更大的侵襲能力和惡性度。對于膠質(zhì)瘤惡性程度是否與MGMT的表達有關的問題，本研究結(jié)果顯示不同惡性程度膠質(zhì)瘤MGMT陽性表達率沒有統(tǒng)計學差異，但表達強度之間具有一定的差異，其他研究也證實在低級別膠質(zhì)瘤中MGMT的表達陽性強度更大。而高級別膠質(zhì)瘤中表達強度相對較?。?］，這就削弱了對烷基化的保護能力，使抑癌基因突變增多，且功能被抑制，使癌細胞具備更強的增值能力和侵襲性。從另一方面說，正常活性的MGMT對維持基因組的穩(wěn)定性及細胞的正常生理功能有一定作用。就惡性度高腫瘤組織內(nèi)MGMT的減弱機制而言，可能是MGMT啟動子區(qū)異常甲基化，使之出現(xiàn)MGMT的低表達而產(chǎn)生的［9］。異常甲基化所致的MGMT低表達也是膠質(zhì)瘤對烷化劑類化療藥物的敏感因素之一［10］。

綜上所述，P53與MGMT表達在不同級別的膠質(zhì)瘤中均有一定的關系，而且MGMT表達減弱以及P53表達增強會對膠質(zhì)瘤的出現(xiàn)和惡化產(chǎn)生影響。在臨床中動態(tài)觀察P53蛋白及MGMT的表達，進而行基因干預治療也許是未來深入研究的課題之一。

［1］焦保華，劉宏雷，耿少梅，等.MGMT在腦膠質(zhì)瘤中表達的臨床意義及替莫唑胺聯(lián)合放療對預后的影響［J］.內(nèi)蒙古民族大學學報，2009，11（5）：79-80.

［2］潘浩.新型烷化劑替莫唑胺的臨床應用進展［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2010，9（6）：74-75.

［3］Rodriguez FJ，Thibodeau SN，Jenkins RB.et al.MGMT immunohistochemical expression and promoter methylation in human glioblastoma［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2008 116（1）：59-65.

［4］董紅梅，沈忠英.DNA修復酶MGMT與腫瘤關系的研究進展［J］.癌變畸變突變，2003，15（l）：61-62.

［5］方俊杰，趙洪洋.腦膠質(zhì)瘤分子遺傳學研究進展［J］.國外醫(yī)學神經(jīng)病學神經(jīng)外科學分冊，2005，32（l）：45.

［6］張玉林.中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類和分級探討——4373例病理分析［J］.中華病理學雜志，2002，31（5）：420-421.

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［8］Ohgaki H，Kleihues P.Epidemiology and etiology of gliomas［J］.Acta Neuorpathol（Berl），2005，109（1）：93-108.

［9］Freson K，Izzi B，Van Geet C.From genetics to epigenetics in platelet research［J］.Thromb Res，2012，129（3）：325-329.

［10］Madrigano J，Baccarelli A，Mittleman MA，et al.Aging and epigenetics：longitudinal changes in gene-specific DNA methylation［J］.Epigenetics，2012，7（1）：63-70.

（編輯 武玉欣）

The Differencesand Relationsof P53 Protein and MGMTExpression between Different Grade ofGliomas

LIXiang，HAN Sheng，QINXiao-fei，WUAn-hua
（DepartmentofNeurosurgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the P53 protein and O6-methylguanine-DNA methyltransferase（MGMT）expression in differentgrade ofgliomas，and explore theirrelationship with the tumorbiologicalcharacteristics.MethodsThe expression ofP53 and MGMT were detected in 98 different gliomas by using immunohistochemical method.The roles of the two proteins，in the aspects such as tumor invasion，were compared.ResultsNo obvious difference of MGMT expression was found in different grade of gliomas（P=0.462），but the expression intensity was difference（P= 0.019），which was negatively correlated with the grade of tumor（r=-0.629，P＜0.05）.MGMT and P53 in expressing intensity showed a negative correlation（r=-0.750，P＜0.05）.ConclusionP53 and MGMT expression in gliomas have a certain relationship with differentlevels ofglioma；in addition，both increased P53 expression and decreased MGMT expression affects glioma malignancy.

glioma；P53 protein；O6-methylguanine-DNA methyltransferase

R739.4

A

0258-4646（2014）06-0499-04

國家自然科學基金（81172409）

李響（1983-），男，助教，本科.

吳安華，E-mail：wuanhua@yahoo.com

2014-05-05

網(wǎng)絡出版時間：