譚國贛,杜勇立,黃滿紅,張 微

(1.中建五局土木工程有限公司,長沙 410004； 2.湖南省交通規(guī)劃勘察設(shè)計(jì)院,長沙 410008；3.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 201620)

0 引 言

污水處理廠污泥是污水處理的產(chǎn)物,每1×104m3污水經(jīng)處理后約產(chǎn)生污泥(按含水率80%計(jì))5～10×104kg[1].污泥中可能含有大量的重金屬物質(zhì)、病原菌、病毒微生物和大量的毒性有機(jī)物,如不加以妥善處理和處置,將造成堆放和排放區(qū)周圍環(huán)境嚴(yán)重的二次污染,污泥的處置已成為一個(gè)全球性的環(huán)境問題[2-4].

抗生素是廣泛使用的殺菌藥物,經(jīng)人類和動(dòng)物使用后部分進(jìn)入污水處理系統(tǒng)中,微生物在持續(xù)抗生素選擇壓力下產(chǎn)生了耐藥性形成耐藥菌,以及可能通過質(zhì)粒和整合子等廣泛傳播,使得污水處理系統(tǒng)成為抗生素耐藥菌和耐藥基因的儲(chǔ)庫[5-6],而污泥中含有非常高的微生物量和豐富的營養(yǎng),污泥是發(fā)生耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的高發(fā)區(qū),含有耐藥菌和耐藥基因的污泥的使用和填埋,會(huì)增加病原微生物感染人群的風(fēng)險(xiǎn)[7-8].盡管目前對(duì)污泥脫水減容技術(shù)有較多的研究[9-11],但是還沒有對(duì)污泥深度脫水中耐藥菌和耐藥基因的去除特性進(jìn)行研究的報(bào)道.

四環(huán)素具有廣譜抗菌性、毒副作用小、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),是廣泛使用的藥物.其在生物體內(nèi)代謝程度很低,未經(jīng)代謝后的殘留物可在環(huán)境中停留很長時(shí)間,因此在四環(huán)素的持續(xù)壓力下,研究者相繼在污水、飲用水和河水中檢測(cè)出四環(huán)素耐藥菌和四環(huán)素耐藥基因[12-15].本研究采用傳統(tǒng)平板法對(duì)四環(huán)素耐藥菌進(jìn)行測(cè)定,采用RT-PCR對(duì)污水廠中四環(huán)素類耐藥基因數(shù)量進(jìn)行測(cè)定,對(duì)污泥深度脫水中4種四環(huán)素耐藥基因的去除特性進(jìn)行分析,以期為污泥中四環(huán)素類耐藥菌和四環(huán)素耐藥基因的控制提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品的采集

為分析四環(huán)素類耐藥菌和耐藥基因的去除情況,本實(shí)驗(yàn)對(duì)中國南方某大型城市的市政污水處理污泥進(jìn)行采樣測(cè)定,其中原生污泥(即深度處理前污泥)取自某污泥深度處理設(shè)施的進(jìn)料斗,深度脫水后污泥取自該設(shè)施配套的大型污泥填埋場(chǎng).

污泥深度脫水工藝為:原生污泥首先與濃縮污泥(或者自來水)混合至含水率90%左右,然后添加CaO(污泥干基的20%)和FeCl3(污泥干基的3%)調(diào)理,最后經(jīng)板框壓濾至含水率低于60%.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐藥細(xì)菌的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)以LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為可培養(yǎng)菌落數(shù)測(cè)定培養(yǎng)基.將四環(huán)素加入LB培養(yǎng)基中,制成四環(huán)素濃度為20 μg·mL-1的LB培養(yǎng)基作為四環(huán)素耐藥菌選擇性培養(yǎng)基.實(shí)驗(yàn)采用在0.85%生理鹽水中添加0.01%焦磷酸鈉作為稀釋緩沖液對(duì)水樣進(jìn)行震蕩破碎,焦磷酸鈉是解絮凝劑,添加的目的是為了將活性污泥中菌膠團(tuán)打散,以使菌膠團(tuán)中細(xì)菌得到較充分培養(yǎng).無菌操作取水樣5 mL,放于裝有45 mL滅菌緩沖液的三角燒瓶內(nèi),瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量玻璃珠,恒溫?fù)u床內(nèi)180 r/min劇烈震蕩2 h,制成稀釋10-1菌液.出水水樣直接震蕩,不經(jīng)過稀釋.用1 mL滅菌移液吸管吸取稀釋液1 mL,緩慢注入含有9 mL滅菌緩沖液的試管內(nèi),震蕩試管混合均勻,制成10-2稀釋菌液.同法依次連續(xù)稀釋至10-3、10-4、10-5稀釋菌液.針對(duì)每個(gè)采樣點(diǎn)水樣選擇3個(gè)適宜稀釋度,每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行樣,吸取0.1 mL稀釋菌液,加在已滅菌的培養(yǎng)皿中,涂布法涂布均勻,37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù),以上無菌操作均在超凈臺(tái)中進(jìn)行.

1.2.2 四環(huán)素耐藥基因測(cè)定

采用Real-time PCR絕對(duì)定量法,以細(xì)菌16S V3區(qū)通用引物357F、518R擴(kuò)增總菌為內(nèi)參照,檢測(cè)不同水環(huán)境中這些耐藥基因絕對(duì)含量,并與總菌相對(duì)照.設(shè)計(jì)耐藥基因tet(A)、tet(B)、tet(M)和tet(X)特異性引物,并構(gòu)建絕對(duì)定量質(zhì)粒檢測(cè)不同水環(huán)境中這些耐藥基因絕對(duì)含量,并與總菌相對(duì)照.引物序列由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),目的基因片段及方法如表1所示.

表1 4種耐藥基因測(cè)定的引物和方法設(shè)定[16]

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥深度脫水前后性質(zhì)

對(duì)深度脫水污泥的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果見表2和圖1.

表2 深度脫水污泥脫水前后理化特性

污泥填埋場(chǎng)內(nèi)深度脫水污泥為顆粒狀和塊狀,呈灰黃色,結(jié)構(gòu)松散,密實(shí)性較差,含有少量塑料薄膜碎片,由于調(diào)理過程投加大量CaO形成堿性環(huán)境,伴有強(qiáng)烈的氨氣臭味.

2.2 污泥深度脫水對(duì)四環(huán)素耐藥菌的影響

污泥脫水前后四環(huán)素耐藥菌的變化見表3.

表3 污泥脫水前后四環(huán)素耐藥菌的變化

從表3可以看到,污泥深度脫水前后四環(huán)素耐藥菌均存在,經(jīng)深度脫水處理后可培養(yǎng)菌落總數(shù)及四環(huán)素耐藥菌落數(shù)都呈下降趨勢(shì),說明深度處理對(duì)四環(huán)素耐藥菌有一定的去除效果.污泥調(diào)理過程中,除了通過改變斥力,壓縮內(nèi)部結(jié)合水外,還由于在調(diào)理過程中,pH大幅上升至堿性,改變細(xì)菌結(jié)構(gòu)或破壞細(xì)胞,從而去除或者殺死了耐藥菌.四環(huán)素耐藥菌占總菌落數(shù)的百分比沒有明顯下降或上升,相比于脫水前的33.5%,出水仍然保持在31.8%左右.說明深度脫水沒有選擇性地富集或去除四環(huán)素耐藥菌.

2.3 四環(huán)素耐藥基因的去除特性

熒光定量PCR測(cè)定耐藥基因的原理是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加.每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖.實(shí)驗(yàn)獲得的總菌(內(nèi)參)定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖見圖1.

圖1 總菌內(nèi)參定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(橫坐標(biāo)為循環(huán)次數(shù),縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度)

污泥深度脫水前,總菌的基因拷貝數(shù)是4.21×108copies/mL,污泥深度脫水后,總菌的基因拷貝數(shù)是4.21×108copies/mL,去除率是59.62%.tetA,tetB,tetM和tetX的濃度和去除效率如圖2所示.

從圖2中可以看出:

(1) 污泥深度脫水前后中4種四環(huán)素耐藥基因均被檢出,4種四環(huán)素耐藥基因濃度在經(jīng)歷深度脫水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能達(dá)到80%以上,但是tetX的去除率較低,只有45.6%.

(2) 污泥深度脫水過程中四環(huán)素耐藥基因濃度遠(yuǎn)低于總菌濃度,兩者相差1～4個(gè)數(shù)量級(jí).總菌基因的去除率為59.6%,相對(duì)tetA,tetB,tetM來說較低.

(3) 污泥深度脫水后四環(huán)素耐藥基因并沒有全部去除,尤其是tetX的去除率較低,說明經(jīng)過污泥深度脫水處理后,污泥中的耐藥基因還會(huì)對(duì)環(huán)境造成潛在風(fēng)險(xiǎn).

圖2 耐藥基因的濃度和去除效率

3 結(jié) 論

(1) 污泥深度脫水前后四環(huán)素耐藥菌均存在,經(jīng)深度脫水處理后可培養(yǎng)菌落總數(shù)及四環(huán)素耐藥菌落數(shù)都呈下降趨勢(shì),說明深度處理對(duì)四環(huán)素耐藥菌有一定的去除效果.但是深度脫水沒有選擇性地富集或去除四環(huán)素耐藥菌.

(2) 四環(huán)素耐藥基因濃度在經(jīng)歷深度脫水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能達(dá)到80%以上.

(3) 污泥深度脫水處理后不能完全去除耐藥基因,污泥中的耐藥基因還會(huì)對(duì)環(huán)境造成潛在風(fēng)險(xiǎn).

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