王坤林 崔琴 常毅娜 孫妍 郭雯 付真真 曹國慶 楊濤 周紅文

口服他汀類藥物對2型糖尿病患者血清前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9水平的影響

王坤林 崔琴 常毅娜 孫妍 郭雯 付真真 曹國慶 楊濤 周紅文

目的探討2型糖尿病患者在服用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療的過程中血清前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）水平的變化情況。方法采用隨機(jī)抽樣的方法，分別收集31例臨床上需要服用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療的2型糖尿病患者用藥前和用藥4周后的空腹血標(biāo)本。對入選者進(jìn)行病史采集、體格檢查以及血清生化指標(biāo)等的檢測。采用雙抗夾心ELISA的方法檢測患者服藥前后血清PCSK9的水平。結(jié)果他汀類藥物能顯著降低2型糖尿病患者血清TC、LDL?C、TG等的水平（P＜0.01）?？诜☆愃幬镏委熀?型糖尿病患者的血清PC?SK9水平與治療前相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論他汀類藥物的使用可以升高2型糖尿病患者血清PCSK9的水平，并在一定程度上影響他汀的降脂效果。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9；低密度脂蛋白膽固醇；他汀類藥物

臨床上，他汀類藥物作為2型糖尿病人群預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的大血管病變的一線調(diào)脂藥物，其主要作用機(jī)制是通過上調(diào)細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體（low?density lipoprotein receptor，LDLR）的數(shù)目來降低血清膽固醇的水平。雖然目前他汀類藥物的臨床應(yīng)用極其廣泛，但它仍然有一定的局限性。不僅因?yàn)槠淇赡軒淼囊恍┎涣挤磻?yīng)（如肝臟、肌肉等的損害），而且對于一些患者單用他汀類藥物其降脂效果往往不夠理想，即使加大他汀類藥物的使用劑量其降脂能力也只能增加6%左右［1］。因此，對他汀6%法則機(jī)制的探索以及尋找并研發(fā)出新型的調(diào)脂藥物一直是人們研究的方向。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)一種叫做前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin／kexin type 9，PCSK9）的蛋白分子可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用導(dǎo)致細(xì)胞表面LDLR降解增加，細(xì)胞攝取血漿中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholestero，LDL?C）的能力下降，進(jìn)而使得血漿中LDL?C水平升高［2?3］。他汀類藥物在上調(diào)細(xì)胞表面LDLR表達(dá)的同時(shí)是否會(huì)帶來血清PCSK9水平的增加，從而在一定程度上降低了他汀類藥物的降脂效果，尚不明確。為此，本文對31例口服他汀類藥物的2型糖尿病患者進(jìn)行了4周的隨訪研究，探討他汀治療前后血清PCSK9水平的變化情況。

1 資料與方法

1.1 研究人群 隨機(jī)抽取2011年南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科需要使用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療的住院2型糖尿病患者31例。男17例，女14例，年齡41～69歲，平均（60±8）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為22.7～34.8，平均29.8±6.0，臨床上均有給予他汀類藥物進(jìn)行降脂治療的指征，且無他汀類藥物使用的禁忌證。在31例隨訪的患者中，口服氟伐他汀40 mg治療4周者共有19例，口服阿托伐他汀20 mg治療4周者共有12例。

1.2 研究方法

1.2.1 簽訂知情同意書：與入選人群進(jìn)行溝通，告知其本研究的目的、方法、預(yù)期的結(jié)果以及意義；告知其參加本研究后可能帶來的益處、風(fēng)險(xiǎn)和不適；告知其在參與本研究過程中需要配合的項(xiàng)目?；颊吡私馍鲜鰞?nèi)容并表示同意后與其簽訂知情同意書。

1.2.2 相關(guān)問卷調(diào)查：采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的流行病學(xué)調(diào)查表，內(nèi)容主要包括一般情況、飲食和生活習(xí)慣、既往病史、家族史和藥物服用史等。

1.2.3 標(biāo)本的采集及血清脂質(zhì)的測定：經(jīng)靜脈留取研究對象的空腹血置于促凝管中，4℃保存直至離心（2000 r／min，15 min），分離血清并分裝保存于－80℃冰箱。血脂、肝功能等均由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心專業(yè)檢驗(yàn)人員進(jìn)行檢測，使用儀器為全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi7020），其中血清脂質(zhì)成分包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）和LDL?C等均通過酶法定量。

1.2.4 隨訪：告知入選者從服用他汀類藥物進(jìn)行性降脂治療的第1天算起至服藥后的第4周，來醫(yī)院采血檢測肝功能以及血脂等指標(biāo)，另由研究者抽取一管促凝血分離血清后檢測其PCSK9水平。隨訪過程中患者如出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能異常應(yīng)囑其停用他汀類降脂藥物，并在內(nèi)分泌?？漆t(yī)師的指導(dǎo)下改用其他治療方案。本臨床研究中主要使用的他汀類降脂藥物為氟伐他?。▉磉m可）和阿托伐他汀（立普妥），服用的方法分別為40 mg，每晚1次和20 mg，每晚1次。

1.2.5 PCSK9的檢測：利用雙抗夾心ELISA方法檢測血清PCSK9水平，相關(guān)抗體由美國禮來公司研究室提供［4?5］。具體步驟如下：（1）用緩沖液稀釋anti?PCSK9?B9抗體至一定濃度，在酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中各加入100μl，4℃過夜；（2）棄去孔內(nèi)液體，TBST液洗板后加入封閉液，室溫下反應(yīng)1 h；（3）用含1%BSA的分析液依次倍比稀釋PCSK9標(biāo)準(zhǔn)品，并用配制好的分析液處理血樣本，洗板后依次加入酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中，室溫下孵育1.5 h；（4）棄去孔內(nèi)液體，洗板后用含0.1%BSA的分析液稀釋HRP標(biāo)記的抗體（anti?PCSK9?A4抗體），加入各反應(yīng)孔中，室溫下反應(yīng)1 h；（5）于各反應(yīng)孔中加入TMB底物溶液（Pierce）進(jìn)行顯色反應(yīng)，室溫下避光10～30 min，待肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的各孔呈現(xiàn)有明顯的梯度藍(lán)色時(shí)即可終止；（6）終止時(shí)依次每孔加入100μl的終止液，輕輕混勻30 s，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；（7）反應(yīng)終止后立即將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀（CliniBio 128）上于450 nm波長檢測各孔的光密度值（OD值）；（8）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出血樣本的PCSK9值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Epidata進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。服用他汀類藥物前后血清脂質(zhì)水平的變化、肝功能的變化以及PCSK9水平之間的比較采用自身配對t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 降脂治療前后血脂以及肝功能的變化情況 全組治療的2型糖尿病患者在他汀類藥物降脂治療后血清TC、LDL?C、TG均顯著降低（P＜0.01），血清HDL?C水平則無明顯改變。全組患者在使用他汀類藥物治療的過程中沒有出現(xiàn)明顯的肝功能異常。氟伐他汀與阿托伐他汀治療前后患者血清當(dāng)中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1，2）。

2.2 他汀類藥物治療前后血清PCSK9水平的變化情況 全組治療后血清PCSK9水平增加了26.4%；氟伐他汀組治療后血清PCSK9水平增加了26.8%；阿托伐他汀組治療后血清PCSK9水平增加了25.9%。2組患者治療后的血清PCSK9水平與治療前相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（表1，2）。

表1 全組治療前后脂代謝相關(guān)指標(biāo)的變化情況（n＝31，s）

表1 全組治療前后脂代謝相關(guān)指標(biāo)的變化情況（n＝31，s）

注：與治療前比較，??P＜0.01

指標(biāo)治療前治療4周TC（mmol／L）5.93±0.71 3.80±0.44??LDL?C（mmol／L）4.12±0.62 2.45±0.39??TG（mmol／L）1.93±0.93 1.46±0.52??HDL?C（mmol／L）1.03±0.19 0.99±0.23 ALT（U／L）20.8±8.9 24.8±13.8 AST（U／L）25.6±10.0 27.0±13.1 PCSK9（ng／m l）86.87±18.31 109.82±22.66??

表2 2組治療前后脂代謝相關(guān)指標(biāo)的變化情況（s）

表2 2組治療前后脂代謝相關(guān)指標(biāo)的變化情況（s）

注：與治療前比較，?P＜0.05，??P＜0.01

氟伐他汀組（n＝19）指標(biāo)阿托伐他汀組（n＝12）治療前治療4周治療前治療4周TC（mmol／L）5.92±0.76 3.88±0.41??5.95±0.66 3.68±0.46??LDL?C（mmol／L）4.07±0.64 2.43±0.44??4.19±0.60 2.47±0.44??TG（mmol／L）1.92±1.06 1.37±0.40?1.94±0.70 1.6±0.67??HDL?C（mmol／L）1.03±0.20 0.95±0.26 1.03±0.19 1.06±0.17 ALT（U／L）20.4±8.3 26.7±16.3 21.4±10.1 21.9±8.4 AST（U／L）26.0±11.4 29.3±15.7 24.9±7.9 23.3±6.5 PCSK9（ng／ml）79.68±12.47 101.07±17.67??98.26±20.71 123.68±23.41??

2.3 隨訪情況 對31例隨訪者中依從性較好的2例患者進(jìn)行了長達(dá)16周的隨訪。在患者服藥期間，囑咐其每隔4周來醫(yī)院抽血檢測1次血脂，并采其空腹血檢查血清PCSK9的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服氟伐他汀40 mg進(jìn)行治療和服用阿托伐他汀20 mg進(jìn)行治療后，2例患者的血清TC、LDL?C水平在0～4周內(nèi)有明顯的下降，然而隨著治療時(shí)間的延長（4～16周），患者體內(nèi)TC、LDL?C的水平則一直維持在較低水平，沒有更進(jìn)一步的降低（TC分別維持在3.89 mmol／L和3.2 mmol／L左右，LDL?C分別維持在2.80mmol／L和2.10 mmol／L左右）。2例患者的血清PCSK9水平也在降脂治療的前4周內(nèi)有明顯的提高，而隨著治療時(shí)間的延長，血清PCSK9水平則一直維持在較高水平，沒有更進(jìn)一步的升高（PCSK9分別維持在100.00 ng／ml和130.00 ng／ml左右）。

3 討論

血脂異常，尤其是膽固醇水平的異常是引起2型糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的最主要因素，已被大量的流行病學(xué)研究和前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)的結(jié)果所證實(shí)。合理使用降脂藥物，降低血清膽固醇水平對動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)并發(fā)癥的防治具有重大意義。目前臨床上使用的調(diào)脂藥物大致可以分為以下幾類：他汀類調(diào)脂藥、貝特類降脂藥、煙酸類降脂藥以及其他類降脂藥。他汀類藥物作為目前臨床上降低LDL?C水平的一線藥物，其調(diào)脂機(jī)制主要是通過競爭性抑制HMG?CoA還原酶的合成，反饋性刺激肝細(xì)胞表面LDLR的數(shù)目增加，從而加速攝取血漿中的LDL?C。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在使用他汀類藥物進(jìn)行調(diào)脂治療的過程中，可伴有一定程度血清PCSK9水平的升高，并且其升高的程度與他汀類藥物的種類、使用劑量的大小以及治療時(shí)間的長短均有一定的關(guān)系。Dubuc等［6］進(jìn)行的體外研究顯示，運(yùn)用不同種類的他汀類藥物對HepG2肝癌細(xì)胞株進(jìn)行處理后，細(xì)胞內(nèi)PCSK9 mRNA的表達(dá)量顯著增加。并且發(fā)現(xiàn)，在給予不同劑量的阿托伐他汀處理后（0.01～10μmol／L），細(xì)胞表達(dá)LDLRmRNA和PCSK9mRNA的量都隨著阿托伐他汀處理劑量的增加而增加。Careskey等［7］對12例高膽固醇血癥的患者給予40mg／d的大劑量的阿托伐他汀治療16周后發(fā)現(xiàn)，患者血清LDL?C的水平下降了42%的同時(shí)血清PCSK9的水平則升高了34%。本研究對入院后開始使用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療的2型糖尿病患者進(jìn)行了4周的隨訪研究，結(jié)果證明在運(yùn)用他汀類藥物進(jìn)行降脂治療前后，其血清TC、LDL?C水平下降的同時(shí)伴有血清PCSK9水平的顯著升高，且升高的比率達(dá)26.4%，其中氟伐他汀治療組和阿托伐他汀治療組血清PCSK9分別增加了26.8%和25.9%。此外，我們還對2例分別服用氟伐他汀40 mg／d和阿托伐他汀20 mg／d的患者進(jìn)行了16周的隨訪研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在他汀類藥物治療的前4周，其血清TC、LDL?C的水平有較大幅度的下降，而在治療的第4～16周時(shí)間內(nèi)，其血清TC、LDL?C并沒有更進(jìn)一步的下降，而維持在一個(gè)較低的水平。與此同時(shí)，其血清PCSK9的水平在前4周也大幅度上升，而隨著TC、LDL?C水平的穩(wěn)定，在治療的后12周內(nèi)其血清PCSK9水平也一直維持在一個(gè)較高的水平。這一結(jié)果與Welder等［8］研究相類似。由于大量的體內(nèi)體外研究已經(jīng)證明，血清PCSK9可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用降低細(xì)胞表面LDLR的數(shù)目進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇的代謝，然而臨床上他汀類藥物主要是通過升高LDLR的數(shù)目來降低血清當(dāng)中膽固醇的水平。因此，他汀類藥物在升高LDLR的過程中可能反饋性的使得PCSK9的表達(dá)增加從而產(chǎn)生了一定的拮抗作用。這可能在一定程度上解釋了為什么在臨床實(shí)踐中他汀類藥物劑量加倍時(shí)其降脂能力只能增加6%左右。

鑒于最近幾年來的研究結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)既然PCSK9能夠使得LDLR受體降解增加從而導(dǎo)致血清膽固醇水平升高，那么PCSK9抑制劑能否阻斷這一作用途徑，從而成為一種新型的有效的臨床調(diào)脂藥物？目前，已有大量的學(xué)者把目光聚焦在了基于以PCSK9為靶點(diǎn)的藥物研究與研發(fā)當(dāng)中。并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，與PCSK9相關(guān)的抑制劑確實(shí)能夠降低血清中膽固醇的水平。有研究發(fā)現(xiàn)，給轉(zhuǎn)入人PCSK9基因的小鼠靜脈注射一定劑量的小分子干擾RNA（small in?terfering RNA，SiRNA）來降低小鼠體內(nèi)PCSK9 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清中的膽固醇水平有明顯的下降［8］。Gupta等［9］運(yùn)用一種LNA的反義寡核苷酸（其能夠抑制PCSK9 mRNA的合成）對HepG2和HuH7肝癌細(xì)胞株以及小鼠的原代肝細(xì)胞進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)在血清PCSK9水平下降的同時(shí)，小鼠體內(nèi)的膽固醇水平也有顯著的下降。這些研究結(jié)果都在一定程度上說明，PCSK9抑制劑有望作為新型的降脂藥物參與脂代謝相關(guān)性疾病的治療。對于那些不能使用現(xiàn)有的調(diào)脂藥物進(jìn)行治療的患者，PCSK9抑制劑在不久的將來可能會(huì)給他們提供一個(gè)新的治療選擇。此外，鑒于他汀類藥物的調(diào)脂機(jī)制，他汀類藥物聯(lián)合PCSK9抑制劑的運(yùn)用將對那些頑固性的高膽固醇血癥患者帶來更強(qiáng)的臨床降脂效果。

［1］ Jones P，Kafonek S，Laurora I，et al.Comparative dose effi?cacy study of atorvastatin versus simvastatin，pravastatin，lo?vastatin，and fluvastatin in patients with hypercholesterolemia（the CURVES study）［J］.Am J Cardiol，1998，81（5）：582?587.

［2］ Cameron J，Holla OL，Ranheim T，et al.Effect ofmutations in the PCSK9 gene on the cell surface LDL receptors［J］. Hum Mol Genet，2006，15（9）：1551?1558.

［3］ Cao G，Qian YW，Kowala MC，et al.Further LDL cholesterol lowering through targeting PCSK9 for coronary ar?tery disease［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2008，8（4）：238?243.

［4］ Qian YW，Schmidt RJ，Zhang Y，et al.Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through recep?tor?mediated endocytosis［J］.J Lipid Res，2007，48（7）：1488?1498.

［5］ Alborn WE，Cao G，Careskey HE，et al.Serum proprotein convertase subtilisin kexin type 9 is correlated directly with serum LDL cholesterol［J］.Clin Chem，2007，53（10）：1814?1819.

［6］ Dubuc G，Chamberland A，Wassef H，et al.Statins upregulate PCSK9，the gene encoding the proprotein conver?tase neural apoptosis?regulated convertase?1 implicated in fa?milial hypercholesterolemia［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（8）：1454?1459.

［7］ Careskey HE，Davis RA，Alborn WE，et al.Atorvastatin in?creases human serum levels of proprotein convertase subtili?sin／kexin type 9［J］.JLipid Res，2008，49（2）：394?398.

［8］ Welder G，Zineh I，Pacanowski MA，et al.High?dose ator?vastatin causes a rapid sustained increase in human serum PCSK9 and disrupts its correlation with LDL cholesterol［J］. JLipid Res，2010，51（9）：2714?2721.

［9］ Gupta N，F(xiàn)isker N，Asselin MC，et al.A locked nucleic acid antisense oligonucleotide（LNA）silences PCSK9 and en?hances LDLR expression in vitro and in vivo［J］.PLoSOne，2010，5（5）：e10682.

Effect of statins on the serum levelof PCSK 9 in the patientsw ith type 2 diabetesmellitus

WANGKun?lin，CUIQin，CHANG Yi?na，SUN Yan，GUOWen，F(xiàn)U Zhen?zhen，CAO Guo?qing，YANG Tao，ZHOU Hong?wen．Department of Endocrino?logy，the First Affiliated Hospital ofNanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo investigate the effects of statins on the levels of serum PCSK9 in the patientswith type 2 diabetesmellitus.M ethodsFasting blood samples were obtained from 31 patients with type 2 diabetesmellitus before and after 4 weeks'statins therapy.All patients received disease history collection，physical and biochemical examinations. The serum level of PCSK9 wasmeasured with a sensitive and specific sandwich ELISA.ResultsAfter statin therapy，the levels of TC，LDL?C，TG were obviously decreased（P＜0.01），and the levels of serum PCSK9 was significantly increased（P＜0.01）.ConclusionsStatins can significantly enhance the serum level of PCSK9.PCSK9 inhibitorswould be a new?ly promising lipid?lowering drug.

proprotein convertase subtilisin／kexin type 9；low density lipoprotein cholesterol；statins

R 587.1

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.03.020

2013?08?28）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170747）；江蘇省興衛(wèi)工程醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才（H201106）；江蘇省六大人才高峰（2008?18D）

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

周紅文，Email：drhongwenzhou＠gmail.com