趙思越 段 綱 項 勛 代飛燕 常 華

云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650302

紅嘴鷗產酸克雷伯菌的生物學特性

趙思越 段 綱 項 勛 代飛燕 常 華*

云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650302

采集紅嘴鷗的糞便并進行細菌分離培養(yǎng)，首次分離到產酸克雷伯菌。紅嘴鷗產酸克雷伯菌在普通瓊脂、麥康凱、伊紅美藍（EMB）、營養(yǎng)肉湯及SS瓊脂培養(yǎng)基上均可生長，多數為單個存在或兩兩相連，少數依傍聚堆成鋸齒狀排列。本菌為無鞭毛、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，能利用葡萄糖（產酸產氣）、可發(fā)酵乳糖、甘露醇、麥芽糖及蔗糖；靛基質試驗為陽性，MR陰性，VP試驗陽性，不產生H2S，可利用尿素及西蒙氏檸檬酸鹽，但半固體瓊脂（動力）試驗為陰性；本菌對氧氟沙星最為敏感；小白鼠對本菌易感，且腹腔接種易感性高。

紅嘴鷗；產酸克雷伯菌；生物學特性

克雷伯菌屬細菌歸屬于腸桿菌科，分5個種：產酸克雷伯菌（K）、肺炎克雷伯菌（K.）、植生克雷伯菌（K）、土生克雷伯菌（K.）和變形克雷伯菌（K.）[1]。前兩者可導致人畜患病，后三者一般不導致人畜患病。國內外已從兔、烏雞、雞、孔雀等動物體內分離到克雷伯菌[2-5]，目前國內外對肺炎克雷伯菌的研究比較多，而有關產酸克雷伯菌的報道甚少。產酸克雷伯菌是重要的條件致病菌，在自然界曾從植物及水生環(huán)境中檢出，也存在于人和動物腸道，可導致人畜患病[6]。到目前為止，未見季節(jié)性遷徙候鳥紅嘴鷗感染產酸克雷伯菌的報道。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗樣品及試驗動物。采集云南昆明滇池紅嘴鷗糞便50份，健康的昆明系雌雄種小白鼠20只（購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心）。

2）主要儀器。MCV-131BNF無菌超凈臺、MLS-3020高壓滅菌器、MOV-212電熱恒溫干燥箱（SANYO/日本）、恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平（上海）。

3）培養(yǎng)基。根據禽類腸道正常菌群的特點，選用肉湯培養(yǎng)基、血清普通瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基等選擇培養(yǎng)基（購自上海生工生物試劑有限公司）。

表1 產酸克雷伯氏菌在不同條件下的培養(yǎng)特性

1.2 方 法

1）細菌形態(tài)學和培養(yǎng)特性觀察。將采集的紅嘴鷗糞便分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)36～48 h，觀察其生長情況；挑取肉湯培養(yǎng)基中的菌液分別接種于普通瓊脂、麥康凱及伊紅美藍（EMB）瓊脂培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基均勻分成3組，分別置于29℃、37℃、45℃下培養(yǎng)36～48 h，觀察其生長情況；挑取菌落涂片染色鏡檢，觀察其形態(tài)并測定其大小。

2）生化試驗。將分離出的菌種，接種于肉湯培養(yǎng)基擴增，并分別接種于各種生化試驗培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)48～96 h，測定其生化反應。

3）藥敏試驗。將該菌種均勻接種于普通瓊脂平板上，以各種藥敏試紙（頭孢拉定、慶大霉素、阿米卡星、呋喃妥因、氨芐西林、新霉素、妥布霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、阿莫西林、頭孢噻肟）進行藥物敏感性試驗研究。

4）動物接種試驗。將分離出的菌種，接種于肉湯培養(yǎng)基擴增，取菌液分別經皮下、肌肉、尾靜脈、腹腔、滴鼻等途徑接種小鼠進行動物試驗，觀察其致病性。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

本菌在普通瓊脂、麥康凱、伊紅美藍（EMB）、營養(yǎng)肉湯及SS瓊脂培養(yǎng)基上均可生長，在不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)特性見表1。

2.2 細菌形態(tài)及大小

37℃培養(yǎng)40 h觀察，本菌為革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，兩側平直，且長短不一，有的較長。大小為（0.93～1.25）μm×（0.31～0.75）μm。無鞭毛，無芽孢。多數為單個存在或兩兩相連，少數依傍聚堆成鋸齒狀排列。

2.3 生化特性

本菌生化特性見表2，本菌能利用葡萄糖（產酸產氣）、可發(fā)酵乳糖、甘露醇、麥芽糖及蔗糖；靛基質試驗為陽性，M.R陰性，V.P試驗陽性，不產生H2S，可利用尿素及西蒙氏檸檬酸鹽，但半固體瓊脂（動力）試驗為陰性。

表2 產酸克雷伯氏菌生化鑒定結果

2.4 藥物敏感性

本菌除了對阿莫西林耐藥外，對其他抗生藥物皆比較敏感，其中對氧氟沙星最為敏感（表3）。

表3 產酸克雷伯氏菌藥敏實驗結果

2.5 致病性

通過腹腔、尾靜脈、滴鼻、皮下及肌肉分別接種21日齡小鼠，接種量約200 μL原菌液。腹腔接種的小鼠初期癥狀為精神萎靡、毛發(fā)凌亂、活動量小、食欲不佳、扎堆等情況，最短死亡時間為18 h，其余小鼠于48 h前全部死亡；尾靜脈注射和滴鼻途徑的小鼠未見死亡；皮下和肌肉注射僅引起部分小鼠感染死亡，灌胃小鼠于16 h內引起3只小鼠死亡，死亡時均伴有腹瀉癥狀。結果表明，小鼠對本菌易感，且腹腔接種易感性高。

3討 論

細菌分離培養(yǎng)結果表明本菌在普通瓊脂平板上形成灰白色隆起的圓形菌落，麥康凱瓊脂平板上形成表面濕潤、粉紅色的黏稠菌落，營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上形成灰白色隆起的圓形菌落，SS瓊脂平板上形成粉紅色菌落，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，伊紅美藍瓊脂平板上形成表面濕潤的粉紅色黏稠菌落，且菌落較小。生化試驗表明本菌能利用葡萄糖（產酸產氣）、可發(fā)酵乳糖、甘露醇、麥芽糖及蔗糖，靛基質試驗為陽性，M.R陰性，V.P試驗陽性，不產生H2S，可利用尿素及西蒙氏檸檬酸鹽，但半固體瓊脂（動力）試驗為陰性，這些特性可與腸桿菌科的其他屬成員進行鑒別。將上述細菌進行形態(tài)學觀察、革蘭氏染色和生化試驗，與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》比對，判定該菌為產酸克雷伯氏菌。此外，動物致病性試驗表明小鼠對本菌均有易感性，且以腹腔接種最為易感。這與Bleich[10]和 Foreman[11]的報道是相符的，本菌易感染嚙齒類動物。

紅嘴鷗是野生遷徙候鳥，在遷徙過程中細菌感染后都未能及時使用抗生素治療，推測其糞便中分離的細菌應該不會產生耐藥性，因此對本研究中分離得到的產酸克雷伯菌進行藥敏試驗，結果與預期相符，該菌對大多數抗生素藥物皆比較敏感，其中對氧氟沙星最為敏感。如果紅嘴鷗在遷徙過程中受到產酸克雷伯菌大范圍感染，藥敏試驗研究將為其治療提供重要的試驗依據。

產酸克雷伯菌是重要的條件致病菌，主要寄生于人和動物的呼吸道或腸道。紅嘴鷗每年冬天飛到昆明越冬，很多游人來此觀賞，可如果紅嘴鷗攜帶該菌，那糞便是否會通過水源污染，或是否會通過密切接觸而導致人群的感染，這為進一步監(jiān)測紅嘴鷗產酸克雷伯菌提出預警。但紅嘴鷗是重要的保護動物，進行試驗動物模型時不可以選擇紅嘴鷗，而小鼠極易感染該菌，這為進一步研究產酸克雷伯菌的致病性奠定基礎。

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2014-11-20

云南省野生禽類重大動物疫病監(jiān)測

*通訊作者

趙思越，男，1989年生，碩士生。