石月萍

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，錦州 121001）

急性心肌梗死經(jīng)溶栓、冠脈介入治療可以迅速重建血流，但卻伴隨著心肌缺血再灌注損傷 （MIRI）的負(fù)面影響。缺血預(yù)適應(yīng)減輕心肌缺血再灌注損傷成為研究熱點(diǎn)[1]。再灌注損傷補(bǔ)救激酶（reperfusiong injury salvage kinase，RISK）信號通路是細(xì)胞存活的關(guān)鍵機(jī)制之一。已經(jīng)有系列研究表明PI3K-Akt通路途徑參與缺血及藥物預(yù)處理及后處理對再灌注損傷的保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗研究中醫(yī)經(jīng)典方的加減方 （加減枳實(shí)薤白桂枝湯）溫陽通脈方對大鼠缺血再灌注損傷模型心肌壞死標(biāo)記物cTnT含量及心肌akt、bax、bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討其心肌保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1 .1 實(shí)驗動物 健康雄性SD大鼠40只，體重250g～300g，隨機(jī)分為4組，每組10只 （購于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心）。分別為假手術(shù)組、心肌缺血再灌注損傷組 （IR組）、心肌缺血預(yù)適應(yīng)組 （IP組）、溫陽通脈方組 （WY組）。

1.1 .2 藥品與試劑 溫陽通脈方采用全成分 （枳實(shí)、薤白、桂枝等）配方顆粒，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司 (批號130301)。Bax、Bcl-2單克隆抗體 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒 （碧云天生物技術(shù)研究所）；蛋白激酶b試劑盒（北京中杉金橋試劑有限公司）；山羊抗兔IgG抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.1 .3 實(shí)驗儀器 DH-150動物人工呼吸機(jī)：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠。BSM-7105床邊監(jiān)護(hù)儀：光電醫(yī)用電子公司。KB超薄切片機(jī) (EMC6型)：LEICA公司。全自動免疫組化染色儀：美國DAKOCYTOMSTION。光學(xué)顯微鏡：日本奧林帕斯。TWY-16G低溫冷凍離心機(jī)：日本日立公司。全自動生化分析儀HITACHI7080，日本HITACHI7080公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2 .1 實(shí)驗分組及給藥 WY組，每日灌胃1.5ml溫陽通脈方免煎中藥配方顆粒 （4.68g/kg，劑量按人體表面積的0.018計算）2周。其余各組每日灌胃生理鹽水1.5ml連續(xù)2周。假手術(shù)組在大鼠末次灌胃1小時后開胸，冠狀動脈前降支下置線不結(jié)扎。IR組于末次灌胃1小時建立IR模型。IP組于末次灌胃1小時后建立IP模型。WY組于末次灌胃1小時后建立IR模型。

1.2 .2 模型制備 各組大鼠，以烏拉坦 (1g／kg)腹腔注射麻醉。四肢插入針形電極，連接心電監(jiān)護(hù)儀，描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，連接動物呼吸機(jī)行人工呼吸 （正壓呼吸）。自左側(cè)第一、二、三肋開胸，充分暴露心臟及其表面的血管，剪開心包膜，于左心耳根部下方2mm處進(jìn)針，穿過心肌表層在肺動脈圓錐旁出針，將直徑為1.5mm的凹型硅膠管置于結(jié)扎線與血管之間，當(dāng)拉緊結(jié)扎線時，硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而致閉塞。IR組、WY組：結(jié)扎30min后，松解結(jié)扎線，再灌注120min。IP組：缺血5min，再灌注 5min，反復(fù)三次后，拉緊結(jié)扎線30min，然后再灌注120min。假手術(shù)組：只穿線不結(jié)扎。

冠脈結(jié)扎后左室發(fā)紺，心電圖S-T段抬高和 （或）R波高聳；松開結(jié)扎線后，心肌顏色由發(fā)紺轉(zhuǎn)紅，抬高的S-T段和 (或)R波回落，表明心肌再灌注成功。

1.2 .3 指標(biāo)檢測

1.2 .3 .1免疫組織化學(xué)法檢測bax、bcl-2心肌組織切片梯度乙醇脫蠟，微波熱修復(fù)抗原，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化酶活性，血清封閉，滴加稀釋的一抗，4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察照相。每只標(biāo)本隨機(jī)取1張切片，每張切片高倍鏡 (×400)下隨機(jī)選擇5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算該區(qū)域陽性細(xì)胞百分率。

1.2 .3 .2 Western-Blot檢測p-akt置凍存心肌組織100mg于勻漿器中，加入1ml裂解液，勻漿后，4℃15000r/min離心30min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白定量，制成含蛋白相等的樣品。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉的TBS中37℃封閉120min，加入一抗，4℃封閉過夜，洗滌3次，加入二抗，37℃孵育120min，洗滌3次，濾干，按Western blot發(fā)光試劑盒說明書顯影，掃描，測定各組蛋白的相對光密度值。

1.2 .4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS12.0軟件包。計量資料采用組間正態(tài)檢驗，單因素方差分析，組間多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清心肌壞死標(biāo)記cTnT含量 見表1。

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與IR組比較，☆P＜0.05；與IP組比較，■P＞0.05

組別 cTnT （μg/L）假手術(shù)組 1.37±0.20 IR組 8.85±2.50△IP組 5.25±1.65△☆WY組 5.15±1.58△☆■

2.2 各組大鼠心肌組織akt表達(dá) 見表2及圖1。

表2 各組大鼠心肌組織akt的表達(dá) （n=10）

表2 各組大鼠心肌組織akt的表達(dá) （n=10）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01，αP＞0.05；與 IR 組比較，☆P＜0.01，βP＞0.05；與 IP 組比較，■P＞0.05

組別 p-akt（×104） akt（RD） p-akt（RD）假手術(shù)組 0.80±0.12 0.42±0.07 0.20±0.03 IR組 1.53±0.22△ 0.41±0.08α 0.38±0.06△IP組 1.88±0.30△☆ 0.41±0.09αβ 0.49±0.09△☆WY組 1.83±0.38△☆■ 0.40±0.07αβ■ 0.47 ±0.09△☆■

圖1 各組大鼠心肌組織p-akt表達(dá)

2.3 大鼠心肌組織bax、bcl-2表達(dá) 見表3及圖2、3。

表3 各組大鼠心肌組織bax、 bcl-2表達(dá) （n=10）

表3 各組大鼠心肌組織bax、 bcl-2表達(dá) （n=10）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與IR組比較，☆P＜0.01；與IP組比較，■P＞0.05

組別 bax bcl-2假手術(shù)組 0.21±0.08 0.25±0.07 IR組 0.79±0.13△ 0.41±0.09△IP組 0.35±0.09△☆ 0.65±0.11△☆WY組 0.36±0.10△☆■ 0.66±0.14△☆■

圖2 各組大鼠心肌組織bax表達(dá)

圖3 各組大鼠心肌組織bcl-2表達(dá)

3 討論

溫陽通脈方由 《金匱要略》枳實(shí)薤白桂枝湯化裁而來。該方已經(jīng)被歷代醫(yī)家及近現(xiàn)代中醫(yī)藥工作者臨床實(shí)踐所證實(shí)為治療冠心病心絞痛的經(jīng)典方劑。冠心病心絞痛屬于中醫(yī) “胸痹”、 “心痛”等范疇。心肌梗死應(yīng)為 “胸痹”重癥，屬于 “真心痛”范疇。心肌缺血再灌注損傷應(yīng)發(fā)生于心肌梗死之后，因此其證候類似于真心痛。真心痛的病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，病位在心，本虛以心陽氣虛為主，標(biāo)實(shí)以痰濁、血瘀為主[3]。枳實(shí)薤白桂枝湯具有行氣化痰，宣痹通陽作用，在此基礎(chǔ)上加入補(bǔ)氣之人參、活血化瘀之三七，則為溫陽通脈方，全方具有針對真心痛病機(jī)的補(bǔ)氣溫陽化痰活血作用。

前期研究表明，溫陽通脈方能夠縮小心肌梗死面積，抑制細(xì)胞凋亡、改善心肌缺血再灌注損傷的作用[4]，但其具體信號通路機(jī)制尚不明確。

再灌注損傷補(bǔ)救激酶 （reperfusion injury salvage kinase，RISK）信號通路[5]主要包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K-蛋白激酶B（又稱Akt）以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 （ERK1/2）。已有研究表明，PI3K-Akt通路參與缺血及藥物預(yù)處理及后處理對再灌注損傷的保護(hù)作用[6-8]。

PI3K定位于細(xì)胞膜上，Akt通過PI3K的產(chǎn)物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇的作用使自身轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上磷酸化后被激活，稱為依賴PI3K途徑；不被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上活化，稱為非依賴PI3K途徑。當(dāng)Akt在細(xì)胞膜上被激活以后，能夠向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，并與相應(yīng)部位的底物蛋白發(fā)生作用，使底物蛋白特定部位的絲、蘇氨酸發(fā)生磷酸化。激活的Akt可同時磷酸化胞質(zhì)或胞核內(nèi)的多種底物[9]，因此，Akt被認(rèn)為是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)信號通路的中心調(diào)節(jié)器[10]。

Bcl-2是AKT底物之一，能夠通過不同的分子機(jī)制對線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，前者主要有Bcl-2、Bcl-X、Bcl-1、Bcl-W等，后者包括Bax、Bcl-X、Bad、Bak、Bid等，各蛋白之間可相互作用形成同源或異二聚體，構(gòu)成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Bcl-2能和線粒體上的特異位點(diǎn)相結(jié)合，抑制線粒體細(xì)胞色素C的外溢，細(xì)胞色素C的釋放受阻，Caspase-3活性下降進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[11]。

本實(shí)驗觀察了溫陽通脈方預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌壞死標(biāo)記物cTnT含量及PI3k/Akt及其下游分子Bcl-2、bax的表達(dá)影響。通過免疫組化方法檢測大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織中Bcl-2、bax蛋白表達(dá)，采用免疫印跡方法檢測各組Akt和p-akt的表達(dá)，觀察到模型組大鼠心肌組織中Bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平均明顯增加，表明心肌缺血再灌注后促凋亡蛋白表達(dá)增加，而抑制凋亡蛋白表達(dá)也增加。各組Akt表達(dá)量相當(dāng)，而P-akt表達(dá)增加，說明再灌注損傷激活了RISK途徑，使Akt磷酸化，從而上調(diào)抑制凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。而溫陽通脈方與預(yù)處理組的p-akt表達(dá)量明顯高于IR組，使bcl-2蛋白表達(dá)增加，bax蛋白表達(dá)降低，發(fā)揮了內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。藥物干預(yù)組溫陽通脈方的p-akt、bcl-2、bax的表達(dá)量與預(yù)適應(yīng)組的表達(dá)量相當(dāng)，說明其可能具有類似預(yù)適應(yīng)樣的作用。

本研究結(jié)果表明：溫陽通脈方能夠降低心肌壞死標(biāo)記物的含量，能夠上調(diào)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞表達(dá)p-akt、bcl-2，降低bax蛋白表達(dá)，說明溫陽通脈方對大鼠急性心肌缺血引起的心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過預(yù)適應(yīng)樣作用，上調(diào)內(nèi)源性保護(hù)因子p-akt，從而上調(diào)bcl-2，抑制bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

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