黨廣成，季相山，王 慧，劉羽清，付佩勝，劉 洋，趙 燕，宋憬愚

1．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018 2．大連海洋大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023 3．山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東 濟(jì)南 250117

親子鑒定(Parentage testing)是現(xiàn)在法醫(yī)學(xué)上判斷親子關(guān)系以及遺傳特征的重要理論和技術(shù)，其理論依據(jù)是孟德爾的分離定律。按照這一原理，在沒有基因突變和分型錯(cuò)誤的前提下，子代的同對等位基因必定是一個(gè)來自父本，一個(gè)來自母本。因此，根據(jù)子代和母本的等位基因型可以有效的確認(rèn)父本的等位基因類型，以多個(gè)DNA位點(diǎn)的等位基因累計(jì)檢測，達(dá)到檢測親子關(guān)系的目的。親子鑒定的方法有多種，其中以DNA指紋技術(shù)應(yīng)用較為普遍。自Jefferys[1]博士首先將DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)鑒定以來，此方法很快在動物、植物父母本鑒定中得到廣泛發(fā)展和應(yīng)用。尤其是基于微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測方法，使得親子鑒定過程更加快速簡單。

微衛(wèi)星DNA是真核生物基因組重復(fù)序列中的主要組成部分，主要由串聯(lián)重復(fù)單元組成，每單元長度在1～10bp之間，1個(gè)SSR的總長度可達(dá)幾十到幾百個(gè)bp。每個(gè)微衛(wèi)星DNA都由核心序列和側(cè)翼序列組成，其核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列。側(cè)翼DNA序列位于核心序列的兩端，為保守的特異單拷貝序列，能使微衛(wèi)星特異地定位于染色體常染色質(zhì)區(qū)的特定部位[2]。微衛(wèi)星產(chǎn)生是DNA復(fù)制和修復(fù)過程中與滑動錯(cuò)配或染色體減數(shù)分裂時(shí)姊妹染色單體不均等變換的結(jié)果。由于其數(shù)量多、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐富[3，4]、在單個(gè)位點(diǎn)基因呈共顯性遺傳、檢測方法快速穩(wěn)定、所需的DNA量少、易于自動化分析等優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋技術(shù)中有其它遺傳標(biāo)記無法媲美的優(yōu)勢。Bowling等[5]利用微衛(wèi)星位點(diǎn)鑒定出了馬的親本，William等[6]對兩種比目魚進(jìn)行了親本鑒定。在國內(nèi)，張志和等[7]應(yīng)用微衛(wèi)星分型方法有效的確認(rèn)了圈養(yǎng)大熊貓的親緣關(guān)系，孫業(yè)良等[8]用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)從陶賽特羊的嫌疑父本中找出了其父本。

羅非魚起源于非洲，屬熱帶性魚類，棲息于水體的中下層，是以水生植物為主的雜食性魚類。其食性廣，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，抗病性能好，群體產(chǎn)量高，肉味鮮美，國際市場需求量大，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦的水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的種類之一，并已成為可替代逐年短缺的鱈魚等海洋優(yōu)質(zhì)魚的“白色三文魚”。目前，羅非魚及其雜交種已成為全球重要的魚類養(yǎng)殖品種。全球養(yǎng)殖羅非魚的國家達(dá)100多個(gè)，我國是世界上主要的羅非魚養(yǎng)殖國之一，年產(chǎn)量在100×104t以上。羅非魚也是我國出口量最大的魚類品種。然而，羅非魚性成熟早、繁殖力強(qiáng)，當(dāng)年養(yǎng)殖的羅非魚未達(dá)到商品規(guī)格就能自然繁殖，從而造成養(yǎng)殖池塘中出現(xiàn)二代同“塘”的現(xiàn)象，使得養(yǎng)殖密度過大、養(yǎng)殖個(gè)體生長速度減慢、上市規(guī)格減小，養(yǎng)殖效益降低；且羅非魚雄性生長速度顯著快于雌性。因此，培育全雄羅非魚苗種，發(fā)展羅非魚全雄養(yǎng)殖，將顯著提高羅非魚養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展。黨廣成等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在羅非魚性腺分化敏感期高溫處理，可誘導(dǎo)其性逆轉(zhuǎn)，有些家系雄性率甚至達(dá)90%以上。高溫誘導(dǎo)正逐漸發(fā)展成為一種高雄，甚至全雄羅非魚苗種的培育方法。為了篩選獲得性逆轉(zhuǎn)高溫敏感家系，人們就需要建立大量的家系，在各家系系譜不是很清楚的情況下，非常有必要利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定各家系的父母本。

羅非魚良種培育始于30年前，由當(dāng)時(shí)設(shè)于菲律賓的國際水生生物資源管理中心(ICLARM)選擇以四個(gè)非洲品系(埃及、加納、肯尼亞、塞內(nèi)加爾)和四個(gè)亞洲養(yǎng)殖品系(以色列、新加坡、泰國、中國臺灣)的尼羅羅非魚為基礎(chǔ)群，采用家系選育方法進(jìn)行選育，該國際研究項(xiàng)目為Genetic Improvement of Farmed Tilapia，簡稱GIFT，中文譯稱為養(yǎng)殖羅非魚的基因改良)。此后從該中心引入到其它國家的親本種源均為尼羅羅非魚的改良品系，引入中國時(shí)取其項(xiàng)目的縮寫名稱“GIFT”的中譯名“吉富”作為該品系的名稱，由此一直沿用至今。最初吉富品系羅非魚引入中國源于1994年。引進(jìn)吉富羅非魚后，李思發(fā)等又在此基礎(chǔ)上進(jìn)行選育，成功培育了1個(gè)新的羅非魚品種：“新吉富”羅非魚。羅非魚良種培育多數(shù)采用家系選育法，需要建立大量的家系，準(zhǔn)確掌握其系譜資料，有時(shí)也需要借助親子鑒定技術(shù)對其親子關(guān)系進(jìn)行鑒定。因此，篩選一些多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，建立羅非魚微衛(wèi)星指紋技術(shù)意義重大。

羅非魚具有一種奇特的繁殖習(xí)性，雄魚具有非常強(qiáng)的領(lǐng)地性，占領(lǐng)1個(gè)領(lǐng)地后，等待雌魚的到來，雌雄魚追尾后，雌魚產(chǎn)卵，雄魚立即排精，雌魚立馬將受精卵吸入口中，受精卵在口腔中孵化，雌魚下頜突起，嘴呈半張開的樣子，通過鰓腔不斷張合、用水流使卵粒在口中不停翻動進(jìn)行孵育。卵子在口腔中3-7天后即孵出仔魚，此時(shí)的仔魚仍不能獨(dú)立生活，要待其卵黃囊全部吸收后才被雌魚吐出來。這種特異的繁殖習(xí)性為建立家系提供了極大方便，每個(gè)雌魚口腔相當(dāng)于一個(gè)小的家系培養(yǎng)容器。

本文目的就是，首先評價(jià)6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性，評價(jià)微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量對累積非父排除率等的影響，評價(jià)已知一個(gè)雙親或雙親都未知的情況下的累積非父排除率，建立尼羅羅非魚親子鑒定技術(shù)，以期為培育羅非魚良種和高雄性率苗種提供一些技術(shù)支撐。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料取自山東省淡水水產(chǎn)研究所國家級尼羅羅非魚原良種場，是該場于1998年從無錫淡水漁業(yè)研究中心購進(jìn)的尼羅羅非魚吉富品系繁殖、選育6代后的良種。利用20尾雌魚對8尾雄魚的配對方式構(gòu)建羅非魚家系，放養(yǎng)于18 m3的水泥池中，每隔5～7 d檢查1次雌魚口腔，若有卵即取出，標(biāo)記家系號，同時(shí)剪取雌魚(即家系母本)的鰭條，保存于酒精中用于提取DNA，繁殖結(jié)束后，剪取所有雄魚的鰭條，保存于酒精中用于提取DNA。孵化的仔魚養(yǎng)殖2～4個(gè)月后，取鰭條保存于酒精中用于提取DNA。

1.2 DNA的提取

分別選取F33、F34、F35、F36、F37、F52、F53、F55，8個(gè)家系的子代個(gè)體、各家系母本以及8個(gè)候選父本(編號S1―S8)，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿提取法提取DNA。

1.3 DNA樣品的檢測和稀釋

用722分光光度計(jì)測定各DNA樣品的純度和濃度，稀釋至50 ng/μL。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小。

1.4 PCR擴(kuò)增以及產(chǎn)物檢測

通過查閱文獻(xiàn)，得到6個(gè)片段大小在100～300bp之間的微衛(wèi)星位點(diǎn)：UNH719、UNH846、GM435、GM459、GM558、GM024。設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)，梯度PCR檢測出最適退火溫度。

PCR采用15 μL反應(yīng)體系：10×Taq buffer 1.5 μL，MgCl20.9 μL(2 mmol/μL)，dNTP 1.2 μL(1.5 mmol/μL)，上游引物0.5 μL(10 μmol/L)，下游引物0.5 μL(10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，DNA模板1 μL，剩余以水填補(bǔ)。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，退火40 s(見表1退火溫度)，72℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，銀染法染色、顯色后拍照。

表1 引物序列信息

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以及處理分析

對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，然后利用Cervus3.0分析計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)目、等位基因頻率、多態(tài)性信息含量、排除率等相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)各位點(diǎn)的排除率計(jì)算累計(jì)排除率。計(jì)算采用Jamieson等[10]的方法：CPE=1-(1-PE1)(1-PE2)...(1-PEn)。并對各家系進(jìn)行父權(quán)分析，得出置信度。

2結(jié)果

2.1各微衛(wèi)星位點(diǎn)特征分析

利用cervus3.0統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征如表2。各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)在4～12之間，平均等位基因數(shù)為7.17。微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測雜合度在0.313～0.988之間，平均觀測雜合度為0.696。微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度在0.318～0.794之間，平均期望雜合度為 0.638。平均多態(tài)信息含量為0.608，平均等位基因數(shù)為7.17。結(jié)果顯示這六個(gè)位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性。其中GM024、GM435、GM459、UNH846四個(gè)位點(diǎn)的雜合度和多態(tài)信息含量都大于0.5，呈現(xiàn)高度多態(tài)性。

表2各微衛(wèi)星位點(diǎn)特征

2.2排除率分析

各微衛(wèi)星位點(diǎn)的排除率分析結(jié)果見表3，已知一親本時(shí)，各個(gè)位點(diǎn)的非父排除率由0.301～0.818不等，排除率最高的兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記是UNH719和GM558，排除率最低的微衛(wèi)星標(biāo)記是GM024，排除率僅為0.301。雙親未知時(shí)，各位點(diǎn)的累計(jì)排除率在0.113～0.69之間，排除率最高的微衛(wèi)星標(biāo)記是GM558。當(dāng)已知一親本時(shí)，5個(gè)位點(diǎn)的累積排除率就達(dá)到0.9793，6個(gè)位點(diǎn)時(shí)，達(dá)到0.9962。當(dāng)雙親都未知時(shí)，6個(gè)位點(diǎn)的累積排除率也達(dá)到了0.9674。因此，利用這6個(gè)標(biāo)記可很好地對各家系的父本進(jìn)行鑒定。

表3各微衛(wèi)星位點(diǎn)排除率

2.3父權(quán)分析

利用cervus3.0對各家系進(jìn)行父權(quán)模擬分析(Simulation of Paternity Analysis)，根據(jù)LOD值確定各家系真正的父本，各家系父本鑒定結(jié)果見表4，其中F28，F(xiàn)30和F31的真正父本都是S1；F27和F29的真正父本都是S4；F52，F(xiàn)53和F55的真正父本都是S5，而其他后續(xù)父本沒有真正的參與繁殖，這顯示了有些雄魚較為兇猛，獲得了更多的繁殖機(jī)會。UNH719在F31家系中的電泳結(jié)果見圖1，由圖1可非常容易地看出F31家系的真正父本是S1。

Cervus3.0分析顯示，母本已知時(shí)置信度為95%；母本未知時(shí)，置信度降至80%。由于尼羅羅非魚各家系母本已知，因此利用這6個(gè)標(biāo)記可較為準(zhǔn)確地鑒定各家系父本。

表4尼羅羅非魚親子鑒定結(jié)果

圖1 UNH719在F31家系的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.1PolyacrylamidegelelectrophoresisofUNH719locusinF31family

W：母本; M：marker; S1～S8: 候選父本; F1～F20: 子代

3 討論

羅非魚為一種中小型魚，是世界水產(chǎn)業(yè)的重點(diǎn)科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，且被譽(yù)為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一。我國于1978年由長江水產(chǎn)研究所首次引進(jìn)尼羅羅非魚，1994年由上海水產(chǎn)大學(xué)引進(jìn)了尼羅羅非魚吉富品系，1999年無錫淡水漁業(yè)研究中心又從埃及引進(jìn)尼羅羅非魚5000尾，是引進(jìn)規(guī)模最大的一次。除正式的報(bào)道外，我國可能實(shí)際引種的次數(shù)還要多。由于尼羅羅非魚引種次數(shù)較多，引種的規(guī)模較大，未產(chǎn)生嚴(yán)重的遺傳瓶頸。Wang等[11]利用RAPD技術(shù)分析顯示，尼羅羅非魚種內(nèi)相似系數(shù)為0.827。本文利用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析7個(gè)家系個(gè)體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，各位點(diǎn)的平均觀測雜合度為0.696。但必須認(rèn)識到羅非魚種質(zhì)問題的嚴(yán)重性，由于羅非魚種類眾多，且很容易種間雜交，并且雜種可育。如果在一個(gè)有兩種或兩種以上羅非魚存在的水域引種，就很難保證繁殖的種群仍是純種[12]。

羅非魚具有一種奇特的繁殖習(xí)性，雄魚具有非常強(qiáng)的領(lǐng)地性，雌魚口腔含卵孵化，這種特異的繁殖習(xí)性為建立家系提供了極大方便，每個(gè)雌魚口腔相當(dāng)于一個(gè)小的家系培養(yǎng)容器。利用羅非魚這一奇特的繁殖習(xí)性，我們將20尾雌魚和8尾雄魚混養(yǎng)于1個(gè)水泥池，成功地建立了8個(gè)尼羅羅非魚家系。這8個(gè)家系的母本都是已知的，但需要鑒定其父本。

經(jīng)典的親子鑒定方法首先參照母子的基因型，按孟德爾遺傳定律逐個(gè)檢查各個(gè)可疑父親的基因型。只要有一個(gè)基因座的基因型不合，該可疑父親就被排除。最后所剩的惟一可疑父親就被判定為真父。隨著DNA微衛(wèi)星標(biāo)記研究的深入，逐漸將其引入系譜鑒定中來，利用微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性，以多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在一定群體中各等位基因的頻率為基礎(chǔ)，計(jì)算排除概率來進(jìn)行血緣鑒定和血緣控制。用微衛(wèi)星 DNA進(jìn)行親子鑒定具有靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此用微衛(wèi)星 DNA進(jìn)行親子鑒定在目前動物遺傳育種研究中具有十分重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。利用微衛(wèi)星鑒定親子關(guān)系日趨廣泛，10個(gè)以上的位點(diǎn)鑒定較多[13]，但也不乏10個(gè)位點(diǎn)以下的[14]。本文應(yīng)用DNA指紋技術(shù)，在母本已知時(shí)，通過六個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)驗(yàn)證了用微衛(wèi)星進(jìn)行父本鑒定的可行性，有效確認(rèn)了8個(gè)尼羅羅非魚家系的父本。其中母本已知時(shí)非父排除率為0.9962，雙親未知時(shí)非父排除率為0.9674，分別低于Selvamani等[15]利用鮑魚幼體五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)得出的非父排除率0.999和0.995。而Luís等[16]利用六個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)做馬的親本鑒定時(shí)，非父排除率最高達(dá)到99.6%。Fridolfsson等[17]利用三個(gè)多態(tài)性豐富的位點(diǎn)測得非父排除率達(dá)96%，與本文研究非父排除率結(jié)果相近。由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)副疽阎?。說明了在多態(tài)性豐富的情況下，十個(gè)以下的的微衛(wèi)星位點(diǎn)也可以有效鑒定父本。

本實(shí)驗(yàn)研究得知，微衛(wèi)星個(gè)數(shù)、母本是否已知以及置信度水平都會對鑒定產(chǎn)生影響。隨著微衛(wèi)星個(gè)數(shù)的增多，鑒定概率會更準(zhǔn)確。母本已知也顯然能夠提高排除率。置信度水平雖然受軟件限制，但較排除法等方法更加客觀準(zhǔn)確。當(dāng)然基因分型、無效等位基因以及軟件自身缺陷都可能對親子鑒定造成影響。Inoue等[18]就曾分析指出無效等位基因頻率高于5%的位點(diǎn)不可用于家系分析。至于其他影響因素，有待進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。

本文利用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對8個(gè)家系的未知父本進(jìn)行了鑒定，置信度和排除率都達(dá)到了較高的水平，表明利用本法可以有效地鑒定尼羅羅非魚各家系的父本。對尼羅羅非魚各家系的父本進(jìn)行有效的鑒定，有利于尼羅羅非魚(尤其高雄家系)優(yōu)良遺傳資源的保護(hù)，在尼羅羅非魚的養(yǎng)殖推廣和經(jīng)濟(jì)市場化方面有其獨(dú)特的意義。

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