馬 躍，呂 全，于成明,李 琴，劉會(huì)香*，張星耀 *

1．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018 2．國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091 3.山東新河礦業(yè)有限公司嘉祥林場(chǎng)，山東 嘉祥 272400

松材線(xiàn)蟲(chóng)病是以松材線(xiàn)蟲(chóng)[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]為主導(dǎo)，通過(guò)松褐天牛等媒介昆蟲(chóng)傳播的一種重大生物災(zāi)害。我國(guó)于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病，目前已擴(kuò)散蔓延至全國(guó)16個(gè)省(市)，對(duì)我國(guó)現(xiàn)有松林資源、生態(tài)景觀(guān)和林業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了極大破壞和嚴(yán)重威脅。隨著國(guó)際經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來(lái)的日益頻繁，松材線(xiàn)蟲(chóng)病傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)也在不斷加大。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病進(jìn)行了廣泛研究，但該病害發(fā)生和防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，發(fā)病早期不易診斷而無(wú)法及時(shí)采取措施以及感病松樹(shù)難以治愈仍然是松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治的難題。因此，加強(qiáng)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的監(jiān)測(cè)預(yù)警，運(yùn)用簡(jiǎn)單易行的早期診斷方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，徹底清除病死樹(shù)，控制疫情擴(kuò)散，是防治該病的重要手段。本文就國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行的松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)評(píng)述，并對(duì)未來(lái)新技術(shù)的研究進(jìn)行了展望。

1 現(xiàn)行早期診斷技術(shù)評(píng)述

1.1 林間癥狀診斷法

此法是依據(jù)感病植株在田間表現(xiàn)的典型癥狀來(lái)診斷病害。松樹(shù)感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病通常表現(xiàn)如下癥狀和規(guī)律：松樹(shù)感病后針葉逐漸失綠，變黃，最后變?yōu)榧t褐色，倒掛枝上不脫落，遠(yuǎn)觀(guān)似火燒狀，針葉萎蔫是從基部開(kāi)始，通常從局部發(fā)展到整體；發(fā)病樹(shù)樹(shù)干上通常能夠觀(guān)察到天牛產(chǎn)卵刻槽、蛀屑，嫩枝上可見(jiàn)松褐天牛補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的取食痕跡；樹(shù)體流膠減少或停止；木質(zhì)部往往有藍(lán)變現(xiàn)象；感病樹(shù)木通常是樹(shù)冠濃密、樹(shù)勢(shì)健壯的優(yōu)勢(shì)木等[1]。

該方法適用于林間病害普查，適合熟悉當(dāng)?shù)亓窒嗉安∠x(chóng)害發(fā)生與危害情況的相關(guān)技術(shù)人員使用，需憑借豐富的經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷，主觀(guān)性強(qiáng)，容易誤診或漏診。該方法通常僅作為對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的初步判斷，與病原鑒定法結(jié)合應(yīng)用，準(zhǔn)確率高，實(shí)際應(yīng)用普遍。

1.2 病原線(xiàn)蟲(chóng)鑒定法

對(duì)病害最可靠、最直接的診斷方法就是對(duì)其病原物的鑒定。在松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)病早期癥狀不易判斷時(shí)，對(duì)疑似病死樹(shù)取樣的木材進(jìn)行分離線(xiàn)蟲(chóng)并鑒定病原，是松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷的主要方法之一。

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定法 松材線(xiàn)蟲(chóng)主要的形態(tài)學(xué)鑒別特征有：唇區(qū)高，溢縮明顯；口針細(xì)，基部稍微膨大；中食道球橢圓形，占體寬的2/3以上；背食道腺開(kāi)口于中食道球；排泄孔的位置大致和食道球與腸交接處平行；雌蟲(chóng)卵巢1個(gè)，陰門(mén)位于蟲(chóng)體中后部73%處，有陰門(mén)蓋；雄蟲(chóng)交合刺大，弓形，喙突明顯，交合刺遠(yuǎn)端膨大；熱殺死后雌蟲(chóng)呈開(kāi)闊“C”形，雄蟲(chóng)成“J”形。該法應(yīng)用中最大難點(diǎn)在于區(qū)分與松材線(xiàn)蟲(chóng)同屬的無(wú)致病力或致病力弱的擬松材線(xiàn)蟲(chóng)(B.mucronatus)。兩者主要區(qū)別在于：松材線(xiàn)蟲(chóng)雌成蟲(chóng)尾部近圓柱形，尾端鈍圓或有很短的尾尖突(不超過(guò)2 μm)，而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雌成蟲(chóng)尾部有較長(zhǎng)的尾尖突(超過(guò)3.5 μm)；松材線(xiàn)蟲(chóng)雄成蟲(chóng)交合傘為卵圓形，而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)雄成蟲(chóng)交合傘為板狀，端部平截[2-3]。

形態(tài)學(xué)鑒定法操作簡(jiǎn)單易行，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一直是生產(chǎn)和研究上廣泛采用的方法。但也存在一些不足：線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)特征不穩(wěn)定，幼蟲(chóng)期很難鑒別，培養(yǎng)出成蟲(chóng)需要一定時(shí)間；砍取木材耗費(fèi)人力物力且毀壞樹(shù)木，浸泡分離線(xiàn)蟲(chóng)又耗時(shí)；要求分離操作過(guò)程要規(guī)范，鏡檢人員要有豐富經(jīng)驗(yàn)。

1.2.2 生化檢測(cè)法 蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)法 根據(jù)線(xiàn)蟲(chóng)親緣關(guān)系相近的種或種下類(lèi)群的蛋白質(zhì)分子量大小不同，通過(guò)PAGE電泳或瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)凝膠上顯示的蛋白質(zhì)譜帶的不同進(jìn)行分類(lèi)標(biāo)記，即可鑒定松材線(xiàn)蟲(chóng)，由于蛋白質(zhì)呈現(xiàn)的譜帶包含所有可溶性蛋白，所提供的信息復(fù)雜，較難分析，限制了該法的應(yīng)用[4]。

同工酶分析檢測(cè)法 近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)株系進(jìn)行了同工酶差異的研究，篩選出酯酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶[5]等一些可將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)的酶。也有研究表明其特異性不明顯，所需樣本數(shù)量較大，蛋白質(zhì)的表達(dá)影響因素較多，實(shí)際應(yīng)用中存在一定局限性。目前為止，還沒(méi)有哪種同工酶被公認(rèn)為可以明確地區(qū)分松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)。

免疫學(xué)檢測(cè)法 利用免疫學(xué)原理，白鋼等[6]以疫木上分離的松材線(xiàn)蟲(chóng)的粉碎蟲(chóng)體免疫家兔制備抗血清，通過(guò)免疫印跡考察抗血清的特異性，利用固相松材線(xiàn)蟲(chóng)抗原和游離線(xiàn)蟲(chóng)抗原同線(xiàn)蟲(chóng)抗體相競(jìng)爭(zhēng)，建立競(jìng)爭(zhēng)型ELISA法用于松材線(xiàn)蟲(chóng)的分析，同時(shí)還利用抗松材線(xiàn)蟲(chóng)血清建立了在疫木切面上直接進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)抗原的方法。曹宇等[7]用種子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球，以兔抗松材線(xiàn)蟲(chóng)IgG致敏，制備出了能特異性地捕獲松材線(xiàn)蟲(chóng)蛋白抗原的免疫磁性微球，用生物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體，并結(jié)合酶標(biāo)親和素檢測(cè)系統(tǒng)用于疫木樣品的檢測(cè)。該方法可直接捕獲木屑中的微量線(xiàn)蟲(chóng)抗原，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

纖維素酶擴(kuò)散法 纖維素酶是一種與松材線(xiàn)蟲(chóng)病致病性相關(guān)的重要物質(zhì)。Kojima等[8]將松材線(xiàn)蟲(chóng)分泌物進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)分泌的纖維素酶的譜帶類(lèi)型與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的不同。Kikuchi等[9]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該纖維素酶產(chǎn)生于松材線(xiàn)蟲(chóng)的食道腺，并克隆出它的基因。蔣麗雅等[10]利用纖維素酶擴(kuò)散法對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體提取液和分泌液進(jìn)行了定性檢測(cè)，結(jié)果表明松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)含纖維素酶并向體外分泌，而擬松材線(xiàn)蟲(chóng)等其它線(xiàn)蟲(chóng)幾乎不含。張奇等[11]以松材線(xiàn)蟲(chóng)分泌的一種抗原性纖維素酶為指標(biāo)建立了選擇性抗體酶聯(lián)免疫分析方法(SAEIA)，可簡(jiǎn)便、快捷地檢測(cè)出疫木中存在的纖維素酶，具有較好的特異性。

以上幾種松材線(xiàn)蟲(chóng)的生化檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定、易于觀(guān)察、耗時(shí)較短等優(yōu)點(diǎn)，但是所用儀器設(shè)備較為復(fù)雜，技術(shù)要求相對(duì)較高，只適宜于在高等院校、出入境檢疫檢驗(yàn)機(jī)關(guān)等有條件的機(jī)構(gòu)進(jìn)行，不適宜于基層林業(yè)機(jī)構(gòu)。

1.2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)法 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)分析線(xiàn)蟲(chóng)DNA特有的基因組區(qū)域而做出準(zhǔn)確鑒定的方法。松材線(xiàn)蟲(chóng)的DNA較為穩(wěn)定，找到它與其它線(xiàn)蟲(chóng)差異的DNA片段即可作為分子檢測(cè)依據(jù)。相關(guān)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括探針技術(shù)以及基于PCR的各種檢測(cè)技術(shù)，例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、SCAR標(biāo)記、PCR-RFLP、ITS-PCR、特異引物(PCR)、實(shí)時(shí)定量(Real-time PCR)、核酸雜交檢測(cè)(Nucleotide hybridization)等技術(shù)，目前應(yīng)用較多的是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)技術(shù)與SCAR標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。松材線(xiàn)蟲(chóng)分子檢測(cè)試劑盒的研發(fā)使用更為方便快捷。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)克服了形態(tài)鑒定、生理生化檢測(cè)方法存在的一些缺陷，精確度高，越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用，但此類(lèi)技術(shù)只適合于技術(shù)設(shè)備允許的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)用。

1.3 流膠法

松樹(shù)樹(shù)脂分泌減少至停止是感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期癥狀之一，可作為早期診斷的依據(jù)。松樹(shù)分泌樹(shù)脂的能力可分為5個(gè)等級(jí)：一級(jí)流膠，樹(shù)脂從孔口外流，且滲出量很多；二級(jí)流膠，樹(shù)脂從孔口外流，且滲出量較多；三級(jí)流膠，樹(shù)脂沉積在孔口下緣；四級(jí)流膠，樹(shù)脂滲出在圓孔壁上，呈粒狀；五級(jí)流膠，孔壁上無(wú)樹(shù)脂流出。劉偉等[15]將三級(jí)流膠作為感病的標(biāo)志，楊寶君等[16]研究了松樹(shù)品種、接種量及線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源對(duì)流膠法的影響，進(jìn)一步證明了流膠法作為松材線(xiàn)蟲(chóng)病樹(shù)早期診斷的可靠性。

流膠法是最早應(yīng)用于松材線(xiàn)蟲(chóng)病林間活立木早期診斷的方法，該法簡(jiǎn)單、易行、易辨認(rèn)。由于影響松樹(shù)流脂的其他因素較多，影響了該方法診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，且松樹(shù)一旦流膠停止后就很難挽救了，該法僅作為一種輔助診斷方法。

1.4 化學(xué)法

1.4.1 酸性品紅追蹤法 根據(jù)松樹(shù)感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期有揮發(fā)性物質(zhì)滲漏入導(dǎo)管產(chǎn)生氣穴而阻礙樹(shù)液上升的現(xiàn)象，楊偉東等[17-18]采用酸性品紅追蹤樹(shù)液流動(dòng)的情況，根據(jù)莖干橫切面著色情況判斷是否有揮發(fā)性物質(zhì)滲漏入導(dǎo)管，以此判斷是否為松材線(xiàn)蟲(chóng)病。其它原因引起枯萎的松樹(shù)并不會(huì)出現(xiàn)松脂滲漏現(xiàn)象，因此，該法可以在發(fā)病早期還未出現(xiàn)外觀(guān)癥狀時(shí)診斷馬尾松松材線(xiàn)蟲(chóng)病。該方法對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的檢疫防治和品種抗性鑒定研究均有重要意義，但該方法不便于操作，也不能用于林間活立木檢測(cè)，其實(shí)用性還有待于深入研究。

1.4.2 pH指示劑法 王玉嬿、李海燕等[19-21]根據(jù)受害樹(shù)木木材酸度增加的現(xiàn)象，研究出利用酸堿指示劑在松木上的顏色變化來(lái)快速檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)病方法。分別用0.04%的溴酚蘭酒精溶液與0.04%二甲基黃酒精溶液對(duì)待檢松樹(shù)木盤(pán)或木屑進(jìn)行染色，3～5 min后可觀(guān)察到前者染色后健康木為紫羅蘭色，而感病木顏色變?yōu)辄S綠色或黃色，且松材線(xiàn)蟲(chóng)為害越嚴(yán)重黃色越明顯，準(zhǔn)確率可達(dá)85%以上；后者染色后健康木為黃色，而感病木變?yōu)榧t色，且松材線(xiàn)蟲(chóng)為害越嚴(yán)重紅色越明顯，準(zhǔn)確率約60%。

此方法簡(jiǎn)單易行，可達(dá)到快速檢測(cè)的目的，但兩種指示劑均不能將松材線(xiàn)蟲(chóng)和天牛、擬松材線(xiàn)蟲(chóng)等為害的病死木區(qū)分，而且松木的pH值變化與多種因素有關(guān)，存在地域差異和樹(shù)種差異，對(duì)不同樹(shù)種、不同地區(qū)采用的指示劑及其顯色的標(biāo)準(zhǔn)等有待深入研究。

1.4.3 顯色法 王明旭等[22]的實(shí)驗(yàn)將顯色劑加入木屑浸泡液中，感病木的顯色由淺紅色、紅色直到深紅色，且松材線(xiàn)蟲(chóng)含量越多顏色越深，而感染擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的松材呈清白色或無(wú)色，健康木無(wú)色。該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短，具有較好的發(fā)展前景，適用于生產(chǎn)一線(xiàn)監(jiān)管的檢疫檢驗(yàn)人員。

1.5 電生理學(xué)方法

將聲、光、電等多種原理應(yīng)用到植物病害診斷技術(shù)中是一個(gè)很好的研究方向。傅和玉基于植物組織發(fā)生病變?cè)缙?，?xì)胞膜透性改變，電容值急劇縮小這一原理，綜合生物學(xué)、電子學(xué)和傳感技術(shù)研制出了便攜式多種功能植物病害診斷儀[23]，并對(duì)林木枝干傳染性病害腐爛病等和生理性病害低溫災(zāi)害進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，診斷準(zhǔn)確率較高[24]。梁軍等[25]對(duì)受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染與未受侵染的馬尾松樹(shù)體干部電容、電阻、單位電容和枯葉率等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明馬尾松被松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后樹(shù)體電容下降、電阻升高，差異顯著。若以樹(shù)體干部電容值0.50 nF為臨界閾值，低于該值為受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染馬尾松，高于該值為未受侵染馬尾松，準(zhǔn)確率可達(dá)89 %，可以依此診斷病害。

綜合上述兩人研究成果，依據(jù)松樹(shù)感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病后樹(shù)體電容值下降的原理，改進(jìn)植物病害診斷儀，將其應(yīng)用到松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期診斷中，具有很高的研究?jī)r(jià)值。但是目前電指標(biāo)測(cè)定方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)并不具備特異性，電指標(biāo)出現(xiàn)異常只能說(shuō)明樹(shù)木樹(shù)勢(shì)受到了某一或某些因素的干擾，還需要結(jié)合樹(shù)木外觀(guān)癥狀、生理指標(biāo)等其他方法綜合確定具體的干擾因素。該方面技術(shù)的深入研究開(kāi)發(fā)將對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期無(wú)損診斷技術(shù)研究具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。

1.6 光譜學(xué)方法

王震等[26]對(duì)野外不同受害類(lèi)型的馬尾松進(jìn)行了反射光譜測(cè)定，并對(duì)反射率曲線(xiàn)進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明馬尾松不同受害類(lèi)型的光譜特征變化明顯，且呈現(xiàn)出較好的光譜變化規(guī)律，即在綠光區(qū)(550 nm左右)和近紅外區(qū)域(760 nm左右)，隨發(fā)病程度的加深，反射率有明顯的下降。這種變化規(guī)律對(duì)于在松材線(xiàn)蟲(chóng)入侵過(guò)程中，應(yīng)用遙感技術(shù)研究森林資源的動(dòng)態(tài)變化非常有價(jià)值，值得進(jìn)一步研究并應(yīng)用到實(shí)踐中去。

杜華強(qiáng)等[27]對(duì)野外疑似松材線(xiàn)蟲(chóng)的馬尾松進(jìn)行反射光譜連續(xù)測(cè)量，在對(duì)反射光譜數(shù)據(jù)紅邊位置、綠峰反射高度和紅谷吸收深度分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用分形理論計(jì)算450～780 nm之間的反射光譜曲線(xiàn)的分形維數(shù)，可作為馬尾松健康狀況預(yù)測(cè)的指標(biāo)。分形理論在松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期預(yù)測(cè)中具有一定的潛力，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步深入。

1.7 早期檢測(cè)管法

潘滄桑[28]發(fā)明了一種早期檢測(cè)管用于松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期診斷，即將帶有生物活性物質(zhì)的

檢測(cè)管插到樹(shù)上，幾天后通過(guò)檢測(cè)管壁即可知該株松樹(shù)是否有松材線(xiàn)蟲(chóng)。中科院動(dòng)物研究所趙莉藺等人[29]在早期檢測(cè)管的基礎(chǔ)上研發(fā)了松材線(xiàn)蟲(chóng)化學(xué)信息取樣技術(shù)，即在松材線(xiàn)蟲(chóng)不同的生活周期，檢測(cè)管內(nèi)加入不同的化學(xué)信息物質(zhì)對(duì)樹(shù)體內(nèi)松材線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行引誘，再通過(guò)鏡檢形態(tài)鑒定或其他線(xiàn)蟲(chóng)鑒定方法鑒定病原，還對(duì)不同發(fā)病時(shí)期松樹(shù)上取樣部位進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

該方法既實(shí)現(xiàn)了松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷，又可使松樹(shù)免于削皮砍伐之患，達(dá)到保護(hù)松林生態(tài)景觀(guān)的目的。此外，該法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，不必帶大量樣品回室內(nèi)檢測(cè)，減輕了檢疫檢驗(yàn)人員的工作，可以滿(mǎn)足森林防疫機(jī)構(gòu)的需要，適用于野外大規(guī)模病害診斷及普查監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.8 其它方法

1.8.1 松枝解剖法 來(lái)燕學(xué)[30]將便攜式顯微鏡與松枝解剖技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的快速診斷。即剪取松枝后用解剖刀進(jìn)行松枝切片，再用便攜式顯微鏡鏡檢。用該法在林內(nèi)鑒定一個(gè)樣本平均耗時(shí)2.5 min，方法簡(jiǎn)單效率高，但取樣和測(cè)樣過(guò)程具主觀(guān)性，存在漏診或無(wú)法診斷等弊端，有待進(jìn)一步驗(yàn)證改進(jìn)。

1.8.2 松褐天牛引誘輔助診斷法 松材線(xiàn)蟲(chóng)主要依靠松褐天牛攜帶傳播，采用林間掛設(shè)松褐天牛誘捕器或設(shè)立誘木引誘松褐天牛，進(jìn)而分離其成蟲(chóng)體內(nèi)攜帶的松材線(xiàn)蟲(chóng)或由松褐天牛攜帶到誘木上的松材線(xiàn)蟲(chóng)，并鏡檢鑒定線(xiàn)蟲(chóng)的種類(lèi)，可輔助診斷松材線(xiàn)蟲(chóng)病[31]。蔣麗雅等[32]通過(guò)林間設(shè)置松褐天牛引誘劑裝置，對(duì)引誘到的松褐天牛分離其體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)并鏡檢，10min后就能判定有無(wú)松材線(xiàn)蟲(chóng)存在。

該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行，尤其在松褐天牛羽化的高峰期，檢測(cè)效率較高。實(shí)際應(yīng)用中在林間癥狀診斷的基礎(chǔ)上，再結(jié)合病、死樹(shù)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)分離鑒定法或松褐天牛引誘輔助診斷法，可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高診斷的準(zhǔn)確率。

2 展望

松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)研究是實(shí)現(xiàn)這一重大生物災(zāi)害早期預(yù)警的綜合防控關(guān)鍵技術(shù)手段之一。目前很多診斷方法或受條件或受技術(shù)的限制而不完善，尚需繼續(xù)探索和研究。未來(lái)松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)應(yīng)向更為簡(jiǎn)單易行、快速、精確、無(wú)損、高效、適用于林間活立木等方向發(fā)展。

松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷實(shí)用技術(shù)的研究創(chuàng)新可以嘗試從以下幾個(gè)方面突破：pH指示劑法方便快捷，可通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究制定變色標(biāo)準(zhǔn)；研制便攜式儀器用于野外活立木診斷；將納米檢測(cè)手段應(yīng)用到松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)研究中；研究松材線(xiàn)蟲(chóng)分泌的纖維素酶的特異性，并將其作為松材線(xiàn)蟲(chóng)病診斷的特異性信號(hào)應(yīng)用，還有其它一些檢測(cè)信號(hào)在感病樹(shù)體中的分布和捕獲都將是未來(lái)的研究重點(diǎn)；應(yīng)用電學(xué)，光譜學(xué)等物理學(xué)原理進(jìn)行松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期無(wú)損診斷技術(shù)研究也是一個(gè)重要的研究方向，已有研究成果為松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷儀器的研制提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，還有待于深入研究其特異性及實(shí)用性。

松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷技術(shù)的不斷完善創(chuàng)新對(duì)更好地診斷該病害的發(fā)生，從源頭控制病原，防止疫情擴(kuò)散，保護(hù)森林生態(tài)環(huán)境，具有重大的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)與社會(huì)意義。通過(guò)深入研究改進(jìn)現(xiàn)有方法及多學(xué)科相互滲透，松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期診斷技術(shù)將會(huì)取得突破性進(jìn)展。

[1] 萬(wàn)方浩,鄭小波,郭建英.重要農(nóng)林外來(lái)入侵物種的生物學(xué)與控制[M].北京:科學(xué)出版社,2005:573-616

[2] Fukushige H, Futai K. Characteristics of eggs shell and the morphology of female tail-tips of Bursaphelenchus xylophilus, B. lignicolus and some strains of related species from France[J]. Jpn. J. Nemat, 1985, 15: 49-54

[3] Kishi Y. The ping wood nematode and Japanese pine sawyer [M]. Tokyo, Japan：Thomas Co.，Ltd，1995: 302

[4] 張 鍇,梁 軍,張星耀.中國(guó)松萎蔫病病原線(xiàn)蟲(chóng)鑒定及診斷技術(shù)研究[J].中國(guó)森林病蟲(chóng),2011,29(6):31-34

[5] 胡凱基,楊寶君.松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)不同株系酶電泳的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,1995,8(1):73-77

[6] 白 鋼,王玉嬿,馬洪周,等.疫木中松材線(xiàn)蟲(chóng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究[J].林業(yè)科學(xué),2005,41(2):91-95

[7] 曹 宇,李海燕,馬洪周,等.免疫磁性捕獲ELISA技術(shù)在松材線(xiàn)蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].林業(yè)科學(xué)研究,2005,18(5):585-589

[8] Kojima K, Kamijyo A, Masumori M. Cellulase activities of pine wood nematode isolates with different virulences [J]. Jpn For Soc, 1994, 76: 258-262

[9] Kikuchi T, Jones JT, Aikawa T, et al. A family of glycosyl hydrolase family 45 cellulase from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus[J]. FEBS Letters, 2004, 572: 201-220

[10] 蔣麗雅,王曉蕓.松材線(xiàn)蟲(chóng)提取液和分泌液中纖維素酶定性檢測(cè)[J].森林病蟲(chóng)通訊,1995(3):9-12

[11] 張 奇,馬洪周,楊文博,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)纖維素酶的分離純化及免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究[J].南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,39(1):95-99

[12] 湯 堅(jiān),陳鳳毛,葉建仁,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)分子檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2008,22(5):5-9

[13] 王 焱,季 鐳,余本淵,等.3種松材線(xiàn)蟲(chóng)分子檢測(cè)技術(shù)的比較分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,31(4):128-132

[14] 陳鳳毛,葉建仁,吳小芹,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)兩種實(shí)用分子檢測(cè)技術(shù)[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(4):149-152

[15] 劉 偉,楊寶君,徐福元,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷的研究-Ⅰ馬尾松、黑松松材線(xiàn)蟲(chóng)病樹(shù)的早期診斷[J].林業(yè)科學(xué)研究,1998,11(5):455-460

[16] 楊寶君,劉 偉,徐福元,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)病早期診斷的研究-Ⅱ松樹(shù)品種、接種量及線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源對(duì)流膠法的影響[J].林業(yè)科學(xué)研究,1999,12(3):251-255

[17] 楊偉東,蔡思鳴,鄧曉峰.松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)馬尾松的致病性及其早期診斷試驗(yàn)[J].植物檢疫,1993,7(3):177-181

[18] Yang W D. Obserration on early response of Pinus massoniana infected by Bursaphelenchus xylophilus[C]. In: Inernational symposium on pine wilt disease caused by pine wood nematode. Beijing: Forestry press in China,1995

[19] 王玉嬿,宋玉雙,臧秀強(qiáng),等.兩種指示劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病病木的測(cè)試[J].植物病理學(xué)報(bào),1996,26(4):371-376

[20] 王玉嬿.南京地區(qū)黑松、馬尾松松材線(xiàn)蟲(chóng)病病、健木pH值的比較[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,14(增刊):98-102

[21] 王玉嬿,李海燕,舒朝然,等.幾種松樹(shù)松材線(xiàn)蟲(chóng)病木和健木pH值差異的研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2001,31(4(4):342-348

[22] 王明旭,張志飛,羅 寬,等.松材線(xiàn)蟲(chóng)快速檢測(cè)技術(shù)方法的比較研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,30(3):239-242

[23] 傅和玉.植物病害診斷儀的傳感機(jī)理研究[J].北京教育學(xué)院學(xué)報(bào),2000,14(2):43-48

[24] 傅和玉.林木病害早期診斷技術(shù)的研究[J].北京教育學(xué)院學(xué)報(bào),2006,1(1):30-34

[25] 梁 軍,屈智巍,劉惠文,等.楊樹(shù)潰瘍病及松材線(xiàn)蟲(chóng)病對(duì)樹(shù)體干部電指標(biāo)的影響[J].林業(yè)科學(xué),2006,42(12):68-72

[26] 王 震,張曉麗,安樹(shù)杰.松材線(xiàn)蟲(chóng)病危害的馬尾松林木光譜特征分析[J].遙感技術(shù)與應(yīng)用,2007,22(3):367-370

[27] 杜華強(qiáng),葛宏立,范文義,等.分形理論在馬尾松松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)病早期高光譜探測(cè)中的應(yīng)用[J].林業(yè)科學(xué),2009,45(6):68-76

[28] 潘滄桑.松材線(xiàn)蟲(chóng)病的早期診斷檢測(cè)方法[P].中國(guó): CN1167806C,2002

[29] Lilin Zhao, Ping Jiang. Within-tree distribution and attractant sampling of propagative pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus: An early diagnosis approach[J]. Forest Ecology and Management, 2009, 258: 1932-1937

[30] 來(lái)燕學(xué).用松枝解剖法快速檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)病原[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,22(2):188-192

[31] 范軍祥,黃煥華.松材線(xiàn)蟲(chóng)病的診斷方法探討[J].廣東林業(yè)科技,2008,24(5):52-55

[32] 蔣麗雅,周健生.引誘松褐天牛檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的方法[J].森林病蟲(chóng)通訊,1997(3):41-43