蔣佩軍，許小敏，馮偉云，梁珊燕

耐藥鮑曼不動桿菌氟喹諾酮類耐藥基因研究

蔣佩軍，許小敏，馮偉云，梁珊燕

目的了解耐藥不動桿菌氟喹諾酮類耐藥基因的存在狀況。方法GNS-448藥敏卡及K-B法測定抗菌藥物的敏感性，聚合酶鏈反應（PCR）檢測靶位DNA回旋酶編碼基因（gyrA）與拓撲異構酶Ⅳ編碼基因（parC）之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析，以及可移動遺傳元件可介導的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr]。結(jié)果20株不動桿菌對12種常用抗菌藥物嚴重耐藥，對左氧氟沙星耐藥率85%，亞胺培南90%，美洛培南耐藥率達到95%。19株耐藥鮑曼不動桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變（氨基酸序列Ser→Leu）；20株不動桿菌中，parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變（氨基酸序列Ser→Leu）；沒有檢出耐藥鮑曼不動桿菌可移動遺傳元件可介導的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr。結(jié)論鮑曼不動桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關。

不動桿菌，耐藥；-內(nèi)酰胺酶基因；氟喹諾酮類；耐藥基因

據(jù)我國Mohnarin 2011年的監(jiān)測報告顯示，鮑曼不動桿菌重癥監(jiān)護病房（ICU）分離率為21.9%，占ICU病房分離率首位。ICU病房鮑曼不動桿菌分離株的-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的1倍以上，氨基糖苷類耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2～3 倍，氟喹諾酮類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2倍以上[1]。為了解一組（20株）耐藥鮑曼不動桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥機制，筆者對氟喹諾酮類藥物作用靶位DNA回旋酶編碼基因（gyrA）與拓撲異構酶Ⅳ編碼基因（parC）之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）突變分析，以及可移動遺傳元件可介導的喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)進行檢測，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株收集20株耐藥鮑曼不動桿菌分離自2011年2—10月寧波市第二醫(yī)院和浙江省舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院住院患者。

1.2 菌種鑒定及藥敏試驗由于常規(guī)生化鑒定法無法區(qū)分鮑曼不動桿菌/乙酸鈣不動桿菌復合體，因此菌種鑒定為先用法國生物梅里埃公司全自動微生物鑒定儀作初步篩查，繼而本研究參照文獻[2]，采用gyrA測序并經(jīng)BLASTn比對進一步確認為鮑曼不動桿菌。gyrA測序試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。藥敏試驗為K-B法，抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)2011年CLSI進行。

1.3 細菌基因檢測模板制備挑取經(jīng)純培養(yǎng)的單個菌落，置入0.5m leppendorf離心管（內(nèi)有新鮮配制濃度為200 g/L的蛋白酶K溶液400 l），放置56℃水浴2h(消化細菌細胞膜裸露DNA)，然后改放置95℃水浴10 m in(滅活蛋白酶K)。放置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測gyrA、parC基因以及可移動遺傳元件可介導的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰbcr]檢測均為PCR法，氟喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA與parC經(jīng)PCR擴增后另作DNA測序。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對照分子相當?shù)哪康臈l帶為陽性。PCR參數(shù)、靶基因PCR引物序列和基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。

1.5 gyrA、parC基因測序PCR產(chǎn)物測序在美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀上進行)，委托鉑尚(上海)生物技術有限公司完成。

1.6 gyrA、parC基因測得序列比對讀序工具軟件為Chromas，測序結(jié)果用Chromas直接作BLASTSearch比對。

2 結(jié)果

2.1 藥敏檢測結(jié)果20株耐藥鮑曼不動桿菌對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁的耐藥率均85%以上；亞胺培南和美洛培南耐藥率分別為90%和95%；哌拉西林/他唑巴坦耐藥率84.2%；左氧氟沙星耐藥率85%；對慶大霉素和阿米卡星30%和10%；氨芐西林/舒巴坦耐藥率21.1%。

2.2 基因檢測狀況20株耐藥鮑曼不

動桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)，parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)，未檢測去移動遺傳元件可介導的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')Ⅰb-cr。

3 討論

喹諾酮類藥物是一族結(jié)構類似于萘啶酸的人工合成抗菌化合物，均有一個喹酮環(huán)，并含氟原子，故亦稱氟喹諾酮類藥物。氟喹諾酮類藥物作用強于萘啶酸。研究表明，氟喹諾酮類藥物會破壞細菌的DNA回旋酶與拓撲異構酶Ⅳ傕化的DNA雙鏈被切斷的斷端重新拼接反應，造成切斷的DNA雙鏈堆積，細菌DNA復制無法完成而死亡[3]。氟喹諾酮類藥物曾是治療鮑曼不動桿菌臨床感染的替代性藥物。但如今鮑曼不動桿菌臨床分離株對氟喹諾酮類藥物耐藥性也在不斷上升趨勢。

革蘭陰性細菌耐氟喹諾酮類藥物原因主要為DNA回旋酶或拓撲異構酶Ⅳ的編碼基因gyrA、parC突變所致。后來，國內(nèi)外學者相繼報道了腸桿菌科細菌的可移動遺傳元件可介導的氟喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19株耐藥鮑曼不動桿菌均檢出gyrA基因QRDR區(qū)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。與本組菌株氟喹諾酮類藥物均不敏感的表型一致。而可移動遺傳元件可介導的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr均沒有檢出。這一結(jié)果文獻[4]報道相同。即鮑曼不動桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關，喹諾酮類藥物與之結(jié)合位置發(fā)生了改變，所形成氫鍵的數(shù)量也減少[5]，導致突變后的基因表達產(chǎn)物(變異的DNA回旋酶或拓撲異構酶Ⅳ)逃逸了氟喹諾酮類藥物的攻擊。

表1 基因檢測PCR引物識別序列和目的產(chǎn)物長度

[1]沈萍,魏澤慶,陳云波,等.Mohnarin2011年度報告:ICU細菌耐藥性監(jiān)測[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2012,22(24):5472-5476.

[2]褚少朋,汪桂華,景蓉蓉,等.一組泛耐藥鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華微生物和免疫學雜志,2012,32(2):157-160.

[3]克里斯托弗·沃爾什.抗生素[M].北京,中國輕工業(yè)出版社,2009:60-61.

[4]耿先龍,王春新,許亞豐,等.泛耐藥鮑氏不動桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2012,35 (11):1048-1050.

[5]Vashist J,Vishvanath,Kapoor R,etal.Interactionofnalidixicacid and ciprofloxacin with type and m utated quinolone-resistance-determ ining region of DNA gyrase A[J].Indian JBiochem Biophys,2009,46 (2):147-153.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.064

R446.5

A

1671-0800(2014)06-0756-02

316000 浙江省舟山，舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院（蔣佩軍）；寧波市第二醫(yī)院（許小敏、馮偉云、梁珊燕）

蔣佩軍，Email:hhllis@163. com