易 敏 王 嶸 陳 璐 沈婷婷 宋連川 種生珍

(青海省第五人民醫(yī)院病理科，西寧 810007)

乳腺癌是最常見危害女性健康的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升及年輕化的趨勢，已躍居城市女性惡性腫瘤的首位，其中乳腺浸潤性導管癌(Breast invasive ductal carcinoma，BIDC)最常見，占乳腺癌70%左右［1，2］。細胞內(nèi)鞘氨醇1 磷酸鹽(Sphingosine 1-phosphate，S1P)水平與其代謝前體神經(jīng)酰胺和鞘氨醇之間的平衡被認為是決定細胞增殖和死亡的開關［3］。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1，SphK1)是調(diào)控這一平衡的決定性因素之一，其促進代謝前體鞘氨醇生成S1P［4］。SphK1 活性可以被很多激動劑(如生長因子)快速激活，從而反映其在控制S1P 水平中發(fā)揮決定性作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)SphK1 在許多實體腫瘤中異常高表達，另外研究證實在乳腺癌和膠質(zhì)母細胞瘤中SphK1 高表達與患者預后不良密切相關，提示SphK1 在人類腫瘤中作為一個潛在促癌因子發(fā)揮功能［6］。本研究通過免疫組化檢測SphK1 蛋白在BIDC 及對應癌旁組織中的表達情況，進一步分析其與BIDC 臨床病理特征的關系，為臨床提供具有潛在應用價值的分子標記和治療新靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機收集本院病理科2008 年1 月至2012 年12 月保存的BIDC 及對應癌旁組織(距腫瘤邊緣大于3 cm)手術(shù)切除標本58 例，所有標本經(jīng)病理確診及常規(guī)相關免疫組化染色。所有患者均為女性，年齡27～74 歲，平均(49±2.9)歲。臨床分期(AJCC，2003 年):Ⅰ+Ⅱ期37 例，Ⅲ+Ⅳ期21 例;病理分級(參照Elston 和Ellis 改良的Scarff-Bloom-Richardson 定量組織學分級法):Ⅰ級8 例，Ⅱ級22例，Ⅲ級28 例;其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26 例。雌激素受體(Estrogen receptor，ER)陽性30 例，陰性28;孕激素受體(Progesterone receptor，PR)陽性26 例，陰性32;人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)陽性10 例，陰性48 例。

1.2 免疫組織化學染色 根據(jù)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的免疫組化試劑盒說明書操作:石蠟包埋組織，對石蠟塊進行4 μm 連續(xù)切片，切片置于37℃烤箱2 h，之后經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精梯度水化，再進行熱抗原修復，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉，將1 ∶75比例稀釋的兔抗人 SphK1 多克隆抗體(HPA022829，Sigma，USA)加于切片。滴加生物素標記的山羊抗兔二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉卵白素工作液。DAB 顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化和稀氨水反藍。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。細胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為SphK1 陽性反應，其表達主要定位于細胞膜、細胞漿和細胞核，根據(jù)陽性細胞百分比進行評分:＜10%=0 分;10%～30%=1分;30%～50%=2 分;＞50%=3 分，評分≥1 分則認為SphK1 蛋白陽性表達［7］。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行分析，采用χ2檢驗檢測SphK1 蛋白表達及其與BIDC臨床病理參數(shù)之間的相關性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BIDC 及對應癌旁組織中SphK1 蛋白的表達 應用免疫組化染色技術(shù)檢測SphK1 在58 例BIDC及對應癌旁組織中表達，腫瘤細胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為SphK1 陽性反應，其表達主要定位于細胞膜、細胞漿和細胞核(圖1)。通過免疫組化評分分為SphK1陽性表達組(評分≥1)和SphK1陰性表達組(評分=0)，SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性率為69.0%(40/58)，在對應癌旁組織中的陽性率為17.2% (10/58)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=31.636，P=0.000)。

表1 SphK1 蛋白表達與BIDC 臨床病理參數(shù)的相關性(n=58)Tab.1 Correlation between clinicopathological characteristics and protein expression of SphK1 in BIDC patients (n=58)

圖1 SphK1 蛋白在BIDC 及對應癌旁組織中的免疫組化染色(SP，×400，標尺:100 μm)Fig.1 Immunohistochemical staining of SphK1 in BIDC and normal tumor-adjacent tissues (SP，×400，Scale bar:100 μm)

2.2 SphK1 蛋白表達與BIDC 臨床病理參數(shù)的關系 SphK1 蛋白表達與BIDC 不同臨床病理參數(shù)的相關性分析詳見表1。結(jié)果顯示SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性表達與ER 陰性(χ2=4.392，P=0.036)、PR 陰性(χ2=7.920，P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.033，P=0.025)和高腫瘤分期(χ2=7.117，P=0.008)有關。

3 討論

S1P 是一個有效的脂質(zhì)介質(zhì)，調(diào)節(jié)一系列的細胞進程如細胞增殖、凋亡、鈣平衡、血管成熟和血管發(fā)生［8］。細胞中S1P 的含量較低，且通過緊密調(diào)節(jié)其合成與降解之間的平衡嚴格維持著S1P 低表達狀態(tài)，而SphK1 在調(diào)控這一平衡中發(fā)揮決定性的作用［9］。重要的是，抑制SphK1 基因表達能夠阻止激動劑誘導的S1P 產(chǎn)生及其下游效應，另外酶活性也證實SphK1 在S1P 效應中發(fā)揮重要作用［10］。許多研究證實SphK1 在促進腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用，另外其在很多抗腫瘤治療中作為治療靶點［11］。SphK1 表達升高已經(jīng)在多種類型的腫瘤被證實，SphK1 mRNA 表達水平在多種腫瘤組織中的表達水平大約是正常組織中的2 倍，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、子宮癌腎癌和直腸癌［12］。人乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌組織免疫組化染色分析提示腫瘤細胞是SphK1 表達的主要來源，這一發(fā)現(xiàn)證實腫瘤細胞通過上調(diào)SphK1 水平從而增加S1P 表達，進而利用S1P 的生長加速特性促進腫瘤進展［13］。本研究通過免疫組化染色檢測SphK1 在BIDC 及對應癌旁組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1 蛋白在BIDC 組織中的陽性表達率顯著高于對應的癌旁組織。French 等［14］檢測了SphK1 mRNA 在一系列實體腫瘤及對應癌旁組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1 mRNA 在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁組織。另外，Ruckh?berle 等［15］檢測了43 種蛋白在乳腺癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)SphK1 蛋白在ER 陰性的乳腺癌組織中顯著高表達。提示本研究結(jié)果與之前報道的SphK1 mRNA 和蛋白在乳腺癌和正常組織中的表達趨勢一致。

在各種腫瘤細胞和動物模型中抗腫瘤治療如化學療法和放射治療能夠下調(diào)SphK1 活性，提示SphK1在抗腫瘤治療中充當感應器角色，因此其高表達能夠抑制腫瘤細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)SphK1 及其產(chǎn)物S1P調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的誘導，而COX-2 是一個公認的結(jié)腸癌發(fā)生促進因子［16］。SphK1 活性下調(diào)增加前列腺癌細胞對凋亡誘導抗腫瘤治療的敏感性，另外上調(diào)SphK1 能夠?qū)苟喾N化療和電離輻射治療［17］。國外研究通過乳腺癌患者生存分析發(fā)現(xiàn)SphK1 高表達患者的預后更差，提示其是一個有價值的預后標志物［14］。本研究通過統(tǒng)計學分析SphK1 蛋白表達與BIDC 不同臨床病理學參數(shù)的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ER 陰性、PR 陰性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高臨床分期的BIDC 組織中SphK1 陽性表達率顯著升高，提示SphK1 高表達與乳腺癌惡性生物學行為相關。綜上所述，SphK1 在BIDC 組織中異常高表達并與惡性臨床病理特征密切相關，提示SphK1 是一個潛在的BIDC 患者預后分子標志物和治療靶點，為進一步探索其功能提供了前期基礎。

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