郭金英 杜 潔 李彤輝 任國(guó)艷 王 萍 張玉先 馮惠敏

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)是一種生活在干旱、半干旱地區(qū)的藍(lán)藻［1］，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)已有近兩千年的歷史。它富含蛋白質(zhì)、多糖、20 多種微量元素和19 種氨基酸，是一種重要的食品和藥品資源［2］。

發(fā)狀念珠藻多糖是一種酸性雜多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸組成，是發(fā)狀念珠藻藻體正常的分泌物質(zhì)，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的天然藥物資源［3］。日本微細(xì)藻類綜合研究所和富山醫(yī)科藥科大學(xué)率先從發(fā)狀念珠藻藻體中分離出多糖，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和生理活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)狀念珠藻在生長(zhǎng)過(guò)程中向細(xì)胞外分泌的多糖具有抗病毒［4］、抗氧化和清除自由基［5］等功效。

近年來(lái)發(fā)狀念珠藻多糖的研究多集中在多糖的分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)等方面。Yu 等［6］研究獲得了發(fā)狀念珠藻胞外多糖和莢膜多糖的理想提取工藝，并得到了單一多糖，并論證了胞外多糖和莢膜多糖對(duì)幾種活性自由基均有清除能力。賈夢(mèng)瑤等［7］對(duì)液體懸浮培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻產(chǎn)生的粗多糖進(jìn)行了質(zhì)量分析。Dai 等［8］采用徑向流色譜法研究了發(fā)狀念珠藻多糖的純化。

藻類多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，它能激活淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成，從而在抗腫瘤方面顯示出獨(dú)特功效。發(fā)狀念珠藻多糖作為一種非常有應(yīng)用前景的生物多糖，其生物活性的研究尚處于起步階段，未見(jiàn)多糖體外活性研究的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻為材料，在前期分離純化發(fā)狀念珠藻胞外多糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化活性的研究，為發(fā)狀念珠藻的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI1640)、胎牛血清和二甲基亞砜(北京康為世紀(jì)有限公司);刀豆蛋白A(ConA)和噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR 小鼠，雄性，體重18～22 g(河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.3 儀器 R205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);LG-5 真空冷凍干燥機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所);722S 可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);TGL-16G 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);E191IR CO2培養(yǎng)箱(GOLD-SIM 公司);Stat Fax 2100 酶標(biāo)儀(北京卓信偉業(yè)科技有限公司)。

1.4 發(fā)狀念珠藻液體培養(yǎng) 活化后的發(fā)狀念珠藻無(wú)菌條件下懸浮于新鮮的100 ml BG-11 培養(yǎng)液中，調(diào)整懸浮液濃度，至A750 nm 約為1。于生化培養(yǎng)箱中在25℃和4 000 Lx 光照強(qiáng)度下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每20 d 為一個(gè)周期。

1.5 發(fā)狀念珠藻胞外多糖制備 熱水提取-木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)-乙醇沉淀-蒸餾水溶解-sevag 試劑脫蛋白-乙醇沉淀-蒸餾水溶解-冷凍干燥。通過(guò)硫酸-苯酚法測(cè)得胞外多糖純度為82.50%。

1.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備 將ICR 小鼠脫頸椎處死，無(wú)菌摘取脾臟，過(guò)200 目網(wǎng)篩，用PBS 液洗滌2～3 次，1 500 r/min 離心10 min;加入紅細(xì)胞裂解液，冰上孵育15 min，450 r/min 離心10 min 收集白細(xì)胞，吸棄上清液;再用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106個(gè)/ml，冷藏備用［9］。

1.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將多糖質(zhì)量濃度設(shè)定在100 μg/ml，設(shè)置7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、36、48、60 和72 h)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化作用的影響。

設(shè)置5 個(gè)多糖濃度梯度(0、25、50、100 和200 μg/ml)，培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞60 h，測(cè)定不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化作用的影響。

1.8 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液及100 μl糖液;空白對(duì)照組加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液和100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液。每組設(shè)5 復(fù)孔，在37℃、CO2濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的一段時(shí)間后，每孔加入20 μl 5 μg/ml 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔吸棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解［10］。酶標(biāo)儀測(cè)其在492 nm 處吸光度。

1.9 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組每孔加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液、100 μl糖液和20 μl 10 μg/ml ConA 溶液;ConA 對(duì)照組加100 μl 脾淋巴細(xì)胞懸液、100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液和20 μl 10 μg/ml ConA 溶液。其他操作方法同1.8。

2 結(jié)果

2.1 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 由圖1 可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性明顯提高，各實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著;與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性顯著提高;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的脾淋巴細(xì)胞一直在增殖，A492nm呈上升趨勢(shì)，且在36、48、60 及72 h 時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)更加明顯，72 h 時(shí)A492nm 達(dá)最大值;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。

圖1 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Temporal-dependent effect of polysaccharose on proliferation of mouse spleen cells

2.2 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響

ConA 具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，單獨(dú)作用于淋巴細(xì)胞時(shí)能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，而當(dāng)ConA與某些抗原共同作用時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞有絲分裂的促進(jìn)作用便形成了特殊的協(xié)同作用。圖2 顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性明顯提高，各實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著;各實(shí)驗(yàn)組和ConA 對(duì)照組的A492 nm 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)一直呈上升趨勢(shì)，且在36、48、60 及72 h 時(shí)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性明顯提高，72 h 時(shí)A492 nm 達(dá)最大值;與各實(shí)驗(yàn)組的ConA 對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性明顯提高，說(shuō)明多糖與ConA 有協(xié)同作用，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。

2.3 不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響見(jiàn)圖3，可以看出，同糖液濃度為零的對(duì)照組相比，糖液濃度為25 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性沒(méi)有顯著提高，而糖液濃度為50、100 和200 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性極顯著提高，說(shuō)明多糖可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并表現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。隨著多糖質(zhì)量濃度的提高，A492nm 先升后降，且在質(zhì)量濃度100 μg/ml 時(shí)取得最大值，其增殖效果最為明顯，而200μg/ml濃度時(shí)，A492nm 下降，說(shuō)明多糖高于一定濃度后，反而對(duì)細(xì)胞分裂起一定抑制作用。

圖2 多糖在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.2 Temporal-dependent effects of polysaccharose on transformation of mouse spleen cells

圖3 不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Dose-dependent effect of polysaccharose on proliferation of mouse spleen cells

圖4 不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.4 Dose-dependent effect of polysaccharose on transformation of mouse spleen cells

2.4 不同濃度多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響 從圖4 可知，在一定劑量范圍內(nèi)多糖與ConA共同作用，能夠顯著提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。同糖液濃度為零的對(duì)照組相比，糖液濃度為25 μg/ml實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性顯著提高，糖液濃度為50、100 和200 μg/ml 實(shí)驗(yàn)組的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性極顯著提高。隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，A492nm 呈先上升后下降趨勢(shì)，且在質(zhì)量濃度100 μg/ml 時(shí)，其轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)，大于100 μg/ml 濃度時(shí)，其轉(zhuǎn)化作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而減弱。

3 討論

脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，是體外試驗(yàn)中淋巴細(xì)胞的重要來(lái)源。脾淋巴細(xì)胞包括T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，并且ConA 及LPS 可以誘導(dǎo)它們活化。脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化活性的檢測(cè)在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能中具有重要意義，其增殖轉(zhuǎn)化效果決定了效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，反映出機(jī)體免疫水平的高低，因此可作為測(cè)定體外免疫活性影響的指標(biāo)。

宋利華等［11］發(fā)現(xiàn)通過(guò)采用柱分離對(duì)人參酸性多糖進(jìn)行逐級(jí)分離，各級(jí)分對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖都有不同程度的促進(jìn)作用，其中GPA-4 刺激作用最強(qiáng)。本研究表明發(fā)狀念珠藻胞外多糖有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，這可能是由于多糖與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)了淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子［12］。脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)不同物質(zhì)刺激后，可以在CO2培養(yǎng)箱72 h 內(nèi)檢測(cè)到其分裂活性，但由于刺激物質(zhì)不一樣，一般最佳培養(yǎng)時(shí)間也不一樣。

周妍［13］研究了不同的海洋微藻對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖作用，發(fā)現(xiàn)不同種類多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用不同。周昌艷等［14］研究結(jié)果表明熱水提取的灰樹(shù)花子實(shí)體多糖與菌絲體多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖作用輕微;堿溶性灰樹(shù)花多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用具有一定的量效關(guān)系。本研究則說(shuō)明一定濃度范圍內(nèi)的發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖作用隨濃度上升而增大。不同物質(zhì)刺激同種類型的細(xì)胞，會(huì)產(chǎn)生不同的應(yīng)答效果，這種免疫應(yīng)答同分子的激活作用，可能與其對(duì)信號(hào)通路的開(kāi)閉的影響有直接關(guān)系。

ConA 為促細(xì)胞有絲分裂素，主要對(duì)T 淋巴細(xì)胞有激發(fā)作用。用ConA 刺激在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的體積會(huì)變大，代謝能力增強(qiáng)，并且蛋白質(zhì)和核酸的合成也有所增加。李江［15］研究了南極適冷菌胞外多糖對(duì)體外細(xì)胞免疫性的影響，結(jié)果表明南極適冷菌胞外多糖協(xié)同ConA 對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的效果明顯高于單獨(dú)施用胞外多糖，且活性表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。Chen 等［16］報(bào)道馬齒莧多糖對(duì)于ConA 誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和LPS 誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化均具有促進(jìn)作用。石磊等［17］觀察巖藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖高、中劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值差明顯高于低劑量組，ConA 與多糖協(xié)同提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。而本研究發(fā)現(xiàn)在ConA 協(xié)同作用下，發(fā)狀念珠藻胞外多糖顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，并呈一定的劑量依賴性。

［1］郭金英，史明科，趙艷麗，等.發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)Cu2+、Cr2+和Pb2+脅迫的響應(yīng)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2013，53(6):553-560.

［2］Ding Z，Jia SR，Han PP，et al.Effects of carbon sources on growth and extracellular polysaccharide production of Nostoc flagelliforme under heterotrophic high-cell-density fed-batch cultures［J］.J Appl Phycol，2013，(25):1017-1021.

［3］Brull LP，Huang Z，Thomas-oates JE，et al.Studies of polysaccharides from three edible species of Nostoc (cyanobacteria)with different colony morphologies:structural characterization and effect on the complement system of polysaccharides Nostoc commune［J］.J Phycol，2000，36:871-881.

［4］Kanekiyo K，Lee JB，Hayashi K，et al.Isolation of an antiviral polysaccharide nostoflan from a terrestrial cyanobacterium Nostoc flagelliforme［J］.J Narural Products，2005，68 (7):1037-1041.

［5］Chen XF，Jia SR，Wang Y，et al.Biological crust of Nostoc flagelliforme (cyanobacteria)on sand bed materials［J］.J Appl Phycol，2011，23:67-71.

［6］Yu HF.Effect of mixed carbon substrate on exopolysaccharide production of cyanobacterium Nostoc flagelliforme in mixotrophic cultures［J］.J Appl Phycol，2012，24:669-673.

［7］賈夢(mèng)瑤，戴玉杰，賈士儒，等.液體懸浮培養(yǎng)發(fā)菜多糖的質(zhì)量分析［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26(10):1076-1080.

［8］Dai YJ，Jia SR，Wang JW，et al.Study on the purification of polysaccharides from Noscoc flagelliforme with radial flow chromatography［J］.Biotechol Bioprocess Engineering，2009，14 (3):377-382.

［9］任國(guó)艷，梁旺春，詹永獻(xiàn)，等.海蜇頭糖蛋白分離純化及免疫活性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(17):147-150.

［10］李法慶，邱大林，陳 蕾.莪術(shù)對(duì)小鼠免疫功能影響的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，16(8):1482-1483.

［11］宋利華，王紅梅，蕭 偉.人參多糖的分級(jí)及其免疫活性初探［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(14):162-166.

［12］陳清華，劉祝英，賀建華.牛膝多糖對(duì)仔豬淋巴細(xì)胞增殖作用和細(xì)胞因子分泌量的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20(6):712-717.

［13］周 妍，王 凌，孫利琴.5 種海洋微藻多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性的篩選［J］.海洋通報(bào)，2010，29(2):194-198.

［14］周昌艷，唐慶九，賈 薇，等.不同來(lái)源灰樹(shù)花多糖免疫活性初探［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2004，11(4):13-17.

［15］李 江，陳靠山，李瑩玉，等.南極適冷菌Pseudoalteromonas sp.S15-13 分子鑒定及其胞外多糖促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用［J］.中國(guó)海洋藥物雜志，2006，25(1):1-5.

［16］Chen YG，Shen ZJ，Chen XP.Evaluation of free radicals scavenging and immunity-modulatory activities of Purslane polysaccharides［J］.Int J Biol Macromol，2009，45(5):448-452.

［17］石 磊，高 欣，趙艷威，等.巖藻多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33(12):194-196.