香山黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定

左山1劉洋2周肖紅3沈悅1李哲1彭程1陳亮3程池2
（1. 北京市廣渠門(mén)中學(xué)，北京 100062；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027；3. 北京市香山公園管理處，北京 100093）

通過(guò)微生物培養(yǎng)方法對(duì)北京香山黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離及篩選，共得到81株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其歸為變形菌門(mén)（Proteobacteria）中的歐文氏菌屬（Erwinia）和志賀氏菌屬（Shigella）；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、柯恩氏菌屬（Cohnella）、類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）；放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）中的短小桿菌屬（Curtobacterium）。這是國(guó)內(nèi)外首次利用培養(yǎng)方法針對(duì)黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究的報(bào)道。

黃櫨 葉 內(nèi)生細(xì)菌 培養(yǎng)方法

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi)，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類(lèi)微生物，它們可以通過(guò)生物防治、植物促生和內(nèi)生固氮等作用直接或者間接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，是植物維持自身健康生長(zhǎng)與適應(yīng)環(huán)境的重要因素之一［1］。目前認(rèn)為，植物內(nèi)生細(xì)菌與植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病害能力、功效性成分產(chǎn)生以及生境生態(tài)平衡穩(wěn)定都具有重要作用，成為當(dāng)前微生物生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域［1］。

黃櫨是優(yōu)良的秋季紅葉樹(shù)種，也是我國(guó)長(zhǎng)江流域、華北、華中地區(qū)常見(jiàn)的荒山綠化樹(shù)種，具有生長(zhǎng)強(qiáng)健及耐貧瘠等特性。黃櫨（Cotinus coggygriavar.cinerea）是構(gòu)成香山紅葉景觀的主體樹(shù)種，香山

1 材料與方法

1.1 材料

黃櫨葉片于2013年7月采集自北京市香山公園，

具體位置為東經(jīng)116.19°，北緯39.99°，海拔181 m。采集所得樣品于4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試劑 LB及R2A成品培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2.2 樣品表面滅菌 稱(chēng)取1 g葉片樣品，并用無(wú)菌水沖洗，之后依次用70%乙醇，次氯酸鈉溶液（2.5%有效Cl-），70%乙醇浸泡3 min，5 min，30 s，再用無(wú)菌水淋洗6次，并于無(wú)菌條件下晾干；同時(shí)取最后一次淋洗水120 μL涂于LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)72 h，以檢測(cè)表面滅菌效果［3］。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 采用劉琳等［4］方法進(jìn)行。將表面滅菌處理的黃櫨葉片置于無(wú)菌研缽中研磨成粉末，然后依次用無(wú)菌水稀釋成濃度為10-1、10-2和10-3懸液。分別取200 μL涂布于R2A和LB平板上，每個(gè)處理3個(gè)平行。28℃培養(yǎng)2-3 d。根據(jù)菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等），隨機(jī)挑取平板上具有差異的代表性菌落，純化后將其接種于斜面培養(yǎng)基，并4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列分析 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取菌株基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3'） 和1 492R（5'-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3'）［5］對(duì)菌株16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、引物27F（10 mmol/L）1 μL、引物1 492R（10 mmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/L）0.25 μL、DNA模板3 μL、ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。1%瓊脂糖檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.5 核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性?xún)?nèi)切酶分型（Amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA） 用HaeIII（TaKaRa）和Hin6I（TaKaRa）兩種內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型，兩種酶帶型完全一致則認(rèn)為是同一種或同一類(lèi)型的細(xì)菌［4］。酶切反應(yīng)體系為 0.4 μL內(nèi)切酶HaeIII（或Hin6I），1.5 μL酶切緩沖液，400 ng PCR產(chǎn)物，最后加滅菌水至15 μL。37℃ 酶切4 h，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，100 V電泳60 min。比較各菌株的酶切圖譜并歸類(lèi)。

1.2.6 細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)定與同源性比對(duì) 經(jīng)ARDRA 初步分型，選取代表菌株進(jìn)行16S rDNA 全長(zhǎng)片段進(jìn)行擴(kuò)增（引物及方法同上）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1.5 kb，采用ABI 3730型DNA測(cè)序儀測(cè)序，將序列信息提交至NCBI，并將測(cè)序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進(jìn)行比對(duì)［6］，確定與已知序列的同源關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌分離及基因組DNA提取

通過(guò)傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)，共獲得黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌81株。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA，1%凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示總DNA大小約為23 kb。

圖1 部分黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA

2.2 黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增及ARDRA 分型

采用細(xì)菌通用引物27F和1492R對(duì)黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約1 500 bp的擴(kuò)增片段，圖2為部分細(xì)菌的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜。將擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物用HaeIII和Hin6I兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分型（ARDRA分型），將兩個(gè)酶切圖譜類(lèi)型完全相同的細(xì)菌劃分為一個(gè)操作分類(lèi)

單元（Operational taxonomy unit，OTU）（圖3）。每種OTU選定1-2個(gè)代表菌株再次進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增以備用測(cè)序。

圖2 部分黃櫨內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA片段擴(kuò)增結(jié)果

圖3 部分黃櫨內(nèi)生細(xì)菌的ARDRA酶切分型結(jié)果

2.3 黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列比對(duì)及其群落多樣性分析結(jié)果如表1所示。經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)及其系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4），內(nèi)生細(xì)菌群落共包含11個(gè)OTU，分屬變形菌門(mén)（Proteobacteria）中的歐文氏菌屬（Erwinia）和志賀氏菌屬（Shigella）；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）、柯恩氏菌屬（Cohnella）、類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）；放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）中的短小桿菌屬（Curtobacterium）。在所分離的得到的81株內(nèi)生細(xì)菌中，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；芽孢桿菌屬（Bacillus）及葡萄球菌屬（Staphylococcus）為優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度分別為53.09%和30.86%。其中，R-54所代表的OTU為該黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中的第一優(yōu)勢(shì)種群；L-20所代表的OTU為該黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中的第二優(yōu)勢(shì)種群（表1）。

表1 黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)

3 討論

植物內(nèi)生細(xì)菌［7-11］存在于植物的根、莖、葉、花果實(shí)及種子中［12，13］，其中不乏一些能夠?qū)χ参锷L(zhǎng)和健康起到直接或者間接促進(jìn)作用的細(xì)菌種類(lèi)，已有很多關(guān)于這些有益內(nèi)生細(xì)菌生態(tài)功能的報(bào)道，其中對(duì)植物的直接促生作用主要包括生物固氮［14，15］、分泌和誘導(dǎo)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)［16，17］、改善植物對(duì)礦物質(zhì)的利用率［18］及改變宿主植物對(duì)霜凍等有害環(huán)境條件的敏感性等［19，20］。對(duì)植物具有間接促生作用有益內(nèi)生細(xì)菌的生態(tài)功能主要是植物內(nèi)生細(xì)菌的生防作用，到目前為止已從眾多植物體中分離得到了具有良好抑制效果的植物內(nèi)生細(xì)菌［12，15，21，22］。

本研究自北京香山紅葉景觀的主體樹(shù)種—黃櫨葉片中分離培養(yǎng)得到7個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌屬，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）最為優(yōu)勢(shì)，該屬中許多細(xì)菌種類(lèi)是常見(jiàn)的植物促生細(xì)菌［23］。本研究分離得到的菌株L-21所對(duì)應(yīng)的最近緣菌種Bacillus aryabhattai是拮抗煙草黑脛?。≒hytophthora parasiticavar.nicotianae）的生防菌［24］；R-15所對(duì)應(yīng)的最近緣菌種蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)鱗翅目、鞘翅

目、雙翅目、膜翅目和同翅目等昆蟲(chóng)，以及動(dòng)植物線(xiàn)蟲(chóng)、蜱螨等節(jié)肢動(dòng)物都有特異性的毒殺活性，而對(duì)非目標(biāo)生物具有較高的安全性，因此在國(guó)內(nèi)外植物保護(hù)相關(guān)領(lǐng)域的科研與實(shí)踐中備受人們關(guān)注［25］。此外，菌株R-22所對(duì)應(yīng)的最近緣菌種解木聚糖類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus xylanilyticus）對(duì)由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）所引起的棉花黃萎病具有明顯的拮抗作用，可用于棉花黃萎病的生物防治［26］。類(lèi)芽孢桿菌屬中不乏具有生防促生作用的細(xì)菌種類(lèi)，宋未等（2007）自水稻根際分離得到多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WY110，該菌對(duì)水稻的三種主要病原菌——稻瘟病、水稻紋枯病及水稻白葉枯病均具有很高的體外特異性拮抗活性，且拮抗譜較寬，并兼具固氮活性及生產(chǎn)生長(zhǎng)素作用，在溫室實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)較好的植株防病效果，普遍達(dá)到50%以上，具有良好的研究與應(yīng)用價(jià)值［27］。宋順華等［28］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WY110對(duì)西瓜枯萎病亦有良好的防治作用。本課題組新近自諾尼（Morinda citrifoliaL.）植物中分離獲得類(lèi)芽孢桿菌CICC 10580，其對(duì)小麥根腐病、稻瘟病菌及棉花黃萎病等多種病原真菌具有明顯的拮抗作用（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

圖4 鄰接法（N-J）構(gòu)建黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由此可見(jiàn)，香山黃櫨葉片內(nèi)生細(xì)菌群落中存在有益細(xì)菌資源。因此，利用多種培養(yǎng)條件進(jìn)一步分離篩選其內(nèi)生細(xì)菌，以獲得種類(lèi)更為豐富的內(nèi)生菌資源，為進(jìn)一步研究其中的有益功能菌種與黃櫨植物的生長(zhǎng)健康及其景觀效果之間的相關(guān)性奠定了微生物資源基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

國(guó)內(nèi)外首次利用微生物培養(yǎng)方法分離篩選黃櫨葉片的內(nèi)生細(xì)菌，分屬變形菌門(mén)中的歐文氏菌屬和志賀氏菌屬，厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌屬、柯恩氏菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，放線(xiàn)菌門(mén)中的短小桿菌屬，其中包含植物生防促生細(xì)菌種類(lèi)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Leaf from Xiangshan Smoke Tree（ Cotinus coggygria var. cinerea）

Zuo Shan1Liu Yang2Zhou Xiaohong3Shen Yue1Li Zhe1Peng Cheng1Chen Liang3Cheng Chi2
（1. Beijing Guang Qumen Middle School，Beijing 100062；2. China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027；3. Beijing Xiangshan Park Management Office，Beijing 100093）

The endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree were isolated, screened and identified by the microbial culturedependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis, indicated that the total 81 strains from the leaves were clustered into 7 genus：Erwinia and Shigella, Bacillus, Cohnella, Paenibacillus and Staphylococcus, and Curtobacterium belonging to Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria, respectively. This is the first report about investigation on the endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree using culture-dependent method.

Smoke tree Leaf Endophytic bacteria Culture-dependent method公園面積約160 hm2，黃櫨數(shù)量約10萬(wàn)余株，主要分布于香山馬蹄形山坳的西南部［2］。近年來(lái)，香山紅葉的培育和病害防治引起廣泛關(guān)注。本項(xiàng)目首次以香山黃櫨葉片為研究對(duì)象，采用微生物培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究這些內(nèi)生細(xì)菌菌種的生物學(xué)功能，以及香山紅葉植物的生長(zhǎng)健康與病害防治奠定微生物資源基礎(chǔ)。

2013-09-04

北京市青少年科學(xué)探索專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項(xiàng)目（2012KJFZ-BS-01）

左山，女，碩士，研究方向：植物微生物生態(tài)學(xué)，E-mail：zuoshanwork@163.com；劉洋同為本文第一作者

程池，男，教授級(jí)高工，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：cheng100027@163.com