馬鈴薯晚疫病防治的轉基因策略

肖歡歡 辛翠花 丁艷 朱佳莉 郭江波
（內(nèi)蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，包頭 014010）

晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的病害，是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展最嚴重的病害之一。采用傳統(tǒng)育種和化學農(nóng)藥等方法防治馬鈴薯晚疫病雖然早有研究，但至今收效甚微?；蚬こ碳夹g的興起為防治馬鈴薯晚疫病提供了新的契機，并已取得了一定成效。但單基因抗性容易喪失、水平抗性應用難度大，要提高抗病基因的持久性，同時釋放多個抗病基因，人為提高田間抗病基因的多態(tài)性是目前可選途徑之一。對各種防治方法進行了綜述，通過轉基因技術創(chuàng)建抗病基因近等混合系是持久防治馬鈴薯晚疫病的首選可行方法，概述了其發(fā)展前景。

馬鈴薯 晚疫病 抗病基因近等混合系

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界第三大糧食作物，栽培面積僅次于水稻和小麥。馬鈴薯糧菜兼用，生育期短，單位面積產(chǎn)量高，而且營養(yǎng)豐富，含有大量淀粉，優(yōu)質蛋白，以及多種維生素和礦物質?，F(xiàn)在全球種植馬鈴薯的國家有148個，總產(chǎn)量達3×108t。馬鈴薯在食物安全系統(tǒng)中將發(fā)揮越來越重要的作用，但耕地面積的減少，對馬鈴薯的生產(chǎn)是一個巨大的挑戰(zhàn)，同時也是馬鈴薯發(fā)展的巨大機遇。國際馬鈴薯中心（CIP）的研究表明，在世界范圍內(nèi)對馬鈴薯的需求到2020年將有望增長20%［1］。但馬鈴薯晚疫病嚴重限制了其產(chǎn)量和發(fā)展，本文就馬鈴薯晚疫病的各種防治方法進行綜述，特別對通過轉基因技術創(chuàng)建抗病基因近等混合系防治馬鈴薯晚疫病的方法進行概述。

1 馬鈴薯晚疫病的危害

晚疫病是由致病疫霉菌（P.infestans）引起的，是引起馬鈴薯產(chǎn)量損失最嚴重的病害之一。馬鈴薯晚疫病大發(fā)生主要與病原菌基數(shù)、品種抗性、氣候因素、栽培模式等密切相關［2］。1847年由于晚疫病傳播引起的饑荒，使100多萬愛爾蘭人死亡，200多萬逃亡海外，史稱愛爾蘭大饑荒（The Great Irish

Famine）［3］。1996年，據(jù)國際馬鈴薯中心（CIP）估計，由于晚疫病的危害使馬鈴薯大量減產(chǎn)，在全球造成170億美元的損失。在我國，馬鈴薯生產(chǎn)也一直受到晚疫病的危害，特別在50年代到60年代初，華北、東北和西北曾幾次發(fā)生晚疫病大流行，使馬鈴薯生產(chǎn)損失過半［4］。因此，防治馬鈴薯晚疫病已成為當今世界馬鈴薯生產(chǎn)和育種工作中的重中之重。

2 晚疫病的防治

晚疫病的發(fā)生易受氣候條件、種薯品種、田間管理等因素的影響［5］。針對其發(fā)病特點和生產(chǎn)方式，現(xiàn)在主要采用的防治技術有農(nóng)業(yè)技術、化學農(nóng)藥和培育抗病品種等。

加強田間管理、采用不同的播種期及種薯處理等農(nóng)業(yè)技術雖然在晚疫病的防治中確實有一定的作用，減輕了晚疫病的危害，但效果并不理想［6］。這些措施只能是預防，“治標不治本”，不能從根本上防治馬鈴薯晚疫病，且工作量大，有時徒作無用功?；瘜W防治仍是目前控制晚疫病流行的主要措施。而致病疫霉菌生理小種進化速度極快，單純靠除草劑、殺蟲劑、銅制劑等化學藥劑來防治晚疫病很快就會使病菌產(chǎn)生抗藥性［5］，從而使病害再度流行，且會有藥害殘留。將不同的化學藥劑組合在一起防治晚疫病，確實取得了一定成效，但由于不同的地區(qū)間存在著致病力和抗藥性不同的生理小種，會大大增加選擇藥劑組合的難度和廣度，一旦病菌產(chǎn)生了抗藥性，前期工作就會前功盡棄。此外，化學農(nóng)藥易污染環(huán)境，成本也較貴，故其應用推廣受到了限制。

因此，培育抗病品種就成了防治馬鈴薯晚疫病切實有效的方法。隨著20世紀抗病育種技術的發(fā)展，馬鈴薯抗晚疫病的遺傳研究取得了突破性進展，育種工作者從野生馬鈴薯品種（Solanum demissum）中鑒定分離出了11個主效抗晚疫病基因（R1、R2、R3……R11），并利用基因滲入等方式將大多數(shù)抗性基因整合進栽培品種中［7］。但晚疫病原菌具有混合的交配方式和高的基因流，屬于進化潛力最高、風險最大、最易克服單一抗病性的病原菌之一［8］。馬鈴薯常規(guī)育種周期長，且這些R基因都是由單基因控制的小種專一抗性，因而經(jīng)多年努力培育的抗病品種很容易被病原菌克服，抗病持久性弱。育種家試圖從其他野生種中尋找新的抗病基因或者利用水平抗性基因來實現(xiàn)持久抗性的目標。但這種途徑也困難重重。有性雜交障礙和連鎖累贅使得從其他野生種中尋找抗病基因導入栽培品種并育成商業(yè)品種非常困難［9］。

20世紀后期轉基因技術的興起為馬鈴薯晚疫病的防治工作提供了新的契機，從抗晚疫病的野生品種中分離出各種抗病基因，并將其轉入到目前栽培品種中的策略，成為目前獲得持久性抗晚疫病的最快捷的手段。

3 馬鈴薯抗晚疫病轉基因研究

近年來馬鈴薯抗晚疫病基因克隆取得了很大的進展，已經(jīng)有來源于野生種S.demissum的R1和R3a及來源于S.bulbocastanum的RB和Rpi-blb2被克?。?0-13］，一些新的抗晚疫病基因被定位［14，15］、馬鈴薯基因組的測序［16］和抗病基因數(shù)據(jù)庫建立［17］為抗晚疫病的轉基因研究奠定了基礎。

馬鈴薯抗晚疫病的轉基因研究近年來也取得了一些效果。如Liu等［18］、Zhu等［19］和李汝剛等［20］分別報道了煙草Osmotin蛋白轉基因馬鈴薯植株可以推遲晚疫病病斑出現(xiàn)時間，降低P.infestans的浸染頻率，賦予葉片抗晚疫病的能力；李汝剛等［21］報道，Harpin基因的組成型表達和病源誘導表達均賦予轉基因馬鈴薯植株抗晚疫病的能力；金紅等［22］將從非洲甜菊中分離出來的類甜蛋白基因（tlp）及其緊密連鎖的抗除草劑bar基因以農(nóng)桿菌介導法導入馬鈴薯中，經(jīng)晚疫病菌游離孢子接種離體抗性分析，轉基因株系表現(xiàn)出對晚疫病的明顯抑制作用和癥狀發(fā)生的延遲作用；Wu等［23］報道葡萄糖氧化酶（go）基因在轉基因馬鈴薯中表達，降低了晚疫病菌對馬鈴薯的浸染速度；崔艷紅等［24］利用VIGS技術研究表明SGT1和HSP90是參與RB和R3a抗病信號傳導途徑過程中的關鍵基因，該技術體系的建立，為發(fā)現(xiàn)新晚疫病抗病相關基因的功能驗證提供了一個高效的技術平臺；辛翠花等［25］通過農(nóng)桿菌介導法將馬鈴薯的抗晚疫病基因R3a和R1分別導入馬鈴薯品種Desiree中，大多數(shù)轉R3a和R1基因的馬鈴薯對對應菌株能夠產(chǎn)生抗性；黃先群等［26］將甜

椒中分離出來的一種過敏反應促進蛋白hrap基因導入馬鈴薯品種“Burbank”中獲得了抗晚疫病植株。

這些方法獲得的抗性苗在一定程度上對晚疫病確實有一定的防治效果，但抗性不能持久，很容易被病原菌克服，從而使病害再度流行。在單基因抗性容易喪失、水平抗性應用難度大的前提下，提高田間抗病基因的多態(tài)性是馬鈴薯抗晚疫病的可行策略之一。提高田間寄主抗性空間多樣性一般采用混合品種或近等混合系來實現(xiàn)［27］。但混合品種不僅抗性基因不同，而且可能熟性及薯塊的其他商品性狀也不同，混合品種法的推廣受到了限制。因而創(chuàng)建抗病基因近等混合系將是持久防治馬鈴薯晚疫病的有效新策略。由于馬鈴薯是基因組高度雜合的同源四倍體作物，有嚴重的自交衰退現(xiàn)象，無法通過回交的方法育成近等混合系。因此，轉基因技術將是創(chuàng)建抗病基因近等混合系的必由之路。

4 田間創(chuàng)建抗病基因近等混合系的基礎

為進一步提高田間抗病基因的多態(tài)性以確保近等混合系在防治馬鈴薯晚疫病上成功應用，還需克隆更多的抗病基因。

Huang等［28］通過連鎖不平衡發(fā)現(xiàn)了一個等位多態(tài)性較高的抗晚疫病基因位點，從野生種S. demissum導入的11個主效基因中有8個（R3，R5-R11）來自于該位點。因此，把它命名為馬鈴薯抗晚疫病主效位點（Major late blight resistance complex，MLB）。馬鈴薯MLB和番茄的抗枯萎病位點I2是同源的，都位于第11號染色體長臂的末端，且都是復合抗病基因位點，因此R3、R5-R11被稱為MLB的單倍型（Haplotypes），而非經(jīng)典意義上的等位基因（Alleles）。通過比較基因組學分析，發(fā)現(xiàn)MLB的R3單倍型有3個抗病基因簇，其中2個基因簇中有功能性的抗病基因，分別是R3a和R3b［29］。在這3個基因簇中發(fā)現(xiàn)的所有抗病基因類似物（40-60個）都是番茄I2基因的同源基因，并運用比較基因組學的方法克隆了R3a基因。在DNA和蛋白質水平上，I2和R3a分別有88%和83%的同一性，都屬于CCNBS-LRR（coiled-coil nucleotide-binding site leucinerich repeat，卷曲螺旋-核苷酸結合位點- 富含亮氨酸重復結構域）類抗病基因。通過比較基因組學的方法來快速挖掘MLB，將為通過基因工程改良的方法構建抗病基因近等混合系，實現(xiàn)馬鈴薯田間抗晚疫病基因多態(tài)性提供原材料，從而達到馬鈴薯晚疫病的持久抗性。

5 展望

轉基因技術在育種中的應用為馬鈴薯抗晚疫病育種創(chuàng)造了許多優(yōu)良的抗病材料，但轉基因技術生物安全性問題也是一個不容忽視的問題。如果在獲得轉基因材料的同時能夠考慮到轉基因產(chǎn)品對生態(tài)環(huán)境、食物及人類健康的影響，通過各種途徑獲得一些生物安全的轉基因產(chǎn)品，并結合傳統(tǒng)常規(guī)育種，建立一個持久的綜合防治體系，真正服務于生產(chǎn)，為我國及世界馬鈴薯晚疫病的有效防治貢獻出一份微薄力量。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Strategy to Control Potato Late Blight by Transgenic Technology

Xiao Huanhuan Xin Cuihua Ding Yan Zhu Jiali Guo Jiangbo
（College of Mathematics, Physics and Biological engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010）

Potato late blight is caused by Phytophthora infestans, which is one of the most serious threats to potato production. In previous research, it proved that it was difficult to control potato late blight by conventional breeding and chemical pesticides. There will be a new opportunity to control potato late blight due to the rise of gene engineering technology, and some success has been achieved. In order to improve the durability of resistance genes, one of the promising solutions for late blight control is to release several R genes simultaneously and artificially create a resistance polymorphism in the field, such as R gene polyculture. Through the comparison of various control methods, the strategy of R gene polyculture by transgenic technology is the first feasible method for controlling potato late blight, and the feasibility and prospects of create R gene polyculture were summarized in the article.

Potato Llate blight R gene polyculture

2013-09-25

國家自然科學基金項目（31260344），內(nèi)蒙古自然科學基金項目（2011BS0506，2012MS0301），內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校科學研究項目（NJZZ11139），內(nèi)蒙古科技大學李保衛(wèi)大學生科技創(chuàng)新基金，內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳“青年科技英才支持計劃”

肖歡歡，男，碩士研究生，研究方向：植物遺傳育種；E-mail：xiaohuan7867@126.com

郭江波，男，副教授，碩士生導師，研究方向：重金屬環(huán)境污染物的植物修復分子機制；E-mail：primersyn@sina.com