孫亞蒙張冬杰汪亮張旭尹雪劉娣，

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

敲減FST基因?qū)ωi成纖維細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的影響

孫亞蒙1張冬杰2汪亮2張旭1尹雪1劉娣1，2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

旨在獲得敲減FST基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞，并探討對相關(guān)基因表達(dá)的影響。將構(gòu)建成功并鑒定準(zhǔn)確的發(fā)夾RNA真核表達(dá)載體FR1-shRNA利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至豬胎兒成纖維細(xì)胞中，并進(jìn)行G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并利用Real-time檢測了相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中，F(xiàn)ST基因的表達(dá)受到顯著抑制，結(jié)果導(dǎo)致了ActivinRⅡA、Myostatin和Bmp4基因的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)趨勢，并且極顯著地降低MyoD基因的表達(dá)。

卵泡抑素（FST） RNA干擾 豬胎兒成纖維細(xì)胞 相關(guān)基因

Follistatin基因編碼的卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)ST）是一種富含半胱氨酸的單鏈糖蛋白，因其對卵泡刺激素有較強(qiáng)的抑制作用，又稱其為促卵泡素（FSH）抑制蛋白。FST基因含6個外顯子（exon）和5個內(nèi)含子（intron），全長約6 000 bp，其中最后一個外顯子編碼了氨基酸前體的C末端，在后期的加工修飾過程中，能形成羧基末端截去27個氨基酸的同系物［1，2］。在功能上，長期以來僅知是一種輔助生殖調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)激素，近年來研究表明，F(xiàn)ST在垂體、腎上腺、骨髓、腎、脂肪、骨骼肌和胰腺等多種組織器官中廣泛表達(dá)［3，4］，在胚胎發(fā)育、紅細(xì)胞生成［5］、神經(jīng)細(xì)胞分化［6］、促進(jìn)骨骼肌發(fā)育［7］等方面發(fā)揮多種生物學(xué)作用。

RNA干擾技術(shù)（RNAi）因其設(shè)計簡單，操作性強(qiáng)，并能高效特異地抑制靶基因的特點(diǎn)，近年來發(fā)展迅速，并成功應(yīng)用于包括人在內(nèi)的多種物種的基因功能研究和基因治療等領(lǐng)域［8］。本研究通過RNAi技術(shù)，利用shRNA載體獲得穩(wěn)定抑制FST基因表達(dá)的豬胎兒成纖維細(xì)胞系，并檢測抑制FST基因表達(dá)后對ActRⅡA、MSTN、Bmp4和MyoD四個基因表達(dá)的影響，旨在為FST基因的功能研究提供一定的試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RNA干擾載體pSilencer4.1-CMV neo購自北京歐比特公司；大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α，購自原平皓生物；限制性內(nèi)切酶、dNTP、DL2000 Marker、rTaq、氨芐青霉素等均購自寶生物工程（大連）有限公司；FST蛋白抗體和豬β-actin蛋白抗體購自TransGen Biotech；蛋白Marker、蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自康為世紀(jì)；SYBR Green PCR Master Mix（5 mL）購自ABI；DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 豬FST基因干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄號為NM_001003662.1提供的mRNA序列，將FST基因完整編碼區(qū)序列輸入ABI公司的在線網(wǎng)站進(jìn)行干擾靶序列的設(shè)計與篩選。最終選擇了3條干擾序列，F(xiàn)R1：5'-GATCCGCCTACTGTGTGACATGTATTCAAGAGATACATGTCACACAGTAGGCTTA-3'；FR2：5'-GATCCCCTACTGGGCAGATCTATTTTCAAGAGAAATAGATCTGCCCAGTAGGTTA-3'；FR3：5'-GATCCCCTCAAGGCCAGATGTAAATTCAAGAGATTTACATCTGGCCTTGAGGTTA-3'，序列兩端分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，以試劑盒所提供的與豬的任何一個基因序列無同源性的非特異性質(zhì)粒作為陰性對照，同時合成其對應(yīng)的互補(bǔ)鏈，退火、連接，構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過測序驗證其準(zhǔn)確性。

1.2.2 豬胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 選取35 d的胎豬，無菌條件下剪去頭、尾和內(nèi)臟，用含高濃度雙抗的PBS將預(yù)處理的組織漂洗5遍，將組織塊剪成1 mm3的小塊，向培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶的消化液37℃消化40 min，每隔10 min搖勻一次，消化后，收集消化液，用200目滅菌的細(xì)胞篩過濾，收集濾液以1 000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀重懸于37℃預(yù)溫的完全培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，或冷凍保存。

1.2.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選 將轉(zhuǎn)化成功的FST-shRNA干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素的抽提和純化，當(dāng)細(xì)胞生長匯合至80%-90%時，使用LipofectamineTM2000（Invitrogen）將上述質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為8 μg質(zhì)粒：20 μL脂質(zhì)體。同時設(shè)置一個正常培養(yǎng)的空白對照組。當(dāng)轉(zhuǎn)染至72 h時，細(xì)胞用400 μg/mL的G418篩選2周，直至空白組細(xì)胞完全死亡，然后使用200 μg/mL的G418維持培養(yǎng)。

1.2.4 Real-time和Western blot方法篩選干擾序列 提取各組細(xì)胞的RNA，利用Invitrogen的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)FST基因mRNA設(shè)計的引物：上游FST1：5'-TGAGGGAAAGTGTATCAAAGC-3'；下游FST2：5'-CTCGGTGTCTTCTGAAATGG-3'。同時使用豬GAPDH基因做內(nèi)參，對FST基因進(jìn)行Real-time檢測。

收集各組細(xì)胞，制備裂解液，離心提取蛋白，BCA試劑盒對提取的蛋白定量，上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、壓片。對FST基因的干擾效率進(jìn)行鑒定。

1.2.5 實(shí)時熒光定量（Real-time）PCR 檢測相關(guān)基因的表達(dá) 收集試驗組、陰性對照組和空白組細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，對各個基因的表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR鑒定。Real-time PCR的反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板0.8 μL，10 μL SYBR Green熒光染料MIX，ddH2O 7.6 μL，上、下游引物各0.8 μL。Real-time PCR程序為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s。自動生成Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行校正，各基因的相對表達(dá)量重復(fù)3次，取平均值。相關(guān)引物序列及參數(shù)見表1。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 不同分組試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，每個試驗組至少3次重復(fù)，結(jié)果用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的序列鑒定

重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，送至Invitrogen進(jìn)行測序，結(jié)果表明所有質(zhì)粒序列均正確無誤，分別命名為FR1-shRNA、FR2-shRNA和FR3-shRNA。

2.2 FST基因干擾效率檢測

將篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的試驗組、陰性對照組和空白組細(xì)胞分別提取總RNA和蛋白，進(jìn)行比較分析，實(shí)時熒光定量PCR（圖1）和Western blot（圖2）的結(jié)果表明，F(xiàn)R1-shRNA組中，F(xiàn)ST基因的表達(dá)

水平顯著低于其他各組，提示FR1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的豬胎兒成纖維細(xì)胞中，F(xiàn)ST基因的表達(dá)受到抑制。

表1 引物序列及參數(shù)

圖1 各RNA干擾組和陰性對照組中FST基因Real-time鑒定結(jié)果

圖2 FST基因干擾后的Western blot鑒定結(jié)果

圖3 Real-time檢測轉(zhuǎn)染前后各基因相對表達(dá)量的變化

2.3 轉(zhuǎn)染前后ActRⅡA、MSTN、Bmp4和MyoD基因表達(dá)的變化

用Real-time方法檢測穩(wěn)定抑制FST基因表達(dá)的成纖維細(xì)胞中ActRⅡA、MSTN、Bmp4和MyoD四個基因表達(dá)量的變化，結(jié)果（圖3）顯示，與陰性對照組和空白組細(xì)胞相比，F(xiàn)ST基因表達(dá)的干擾使MyoD基因的表達(dá)產(chǎn)生了極顯著的下調(diào)（P<0.01），同時其他3個基因的表達(dá)也產(chǎn)生了一定的下調(diào)趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

激活素（activin，ACT）是一種調(diào)節(jié)組織細(xì)胞功能的基本介質(zhì)，它可以通過借助特異性的受體系統(tǒng)，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用［9］。激活素若要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，首先要與Ⅱ型受體（ActivinRⅡA或ActivinRⅡB）結(jié)合，在豬胎兒成纖維細(xì)胞中，F(xiàn)ST的過表達(dá)能夠使ActivinRⅡA基因的表達(dá)量上調(diào)［10］，而本研究中FST基因的抑制導(dǎo)致了ActivinRⅡA基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，揭示了二者之間的表達(dá)存在正相關(guān)的關(guān)系。

TGF-β超家族由一類結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽生長因子亞家族組成，大量試驗結(jié)果表明，F(xiàn)ollistatin能夠通過與TGF-β超家族共有β亞單位與之結(jié)合，從而拮抗其生物活性。Myostatin（MSTN）是已知的最強(qiáng)的骨骼肌生長抑制物，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bmp4）不僅能誘導(dǎo)骨的形成，同時還對動物生殖系統(tǒng)的生殖發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用［11］。MSTN和Bmp4都是TGF-β超家族的成員，F(xiàn)ST基因的過表達(dá)能夠引起二者表達(dá)量的下調(diào)［10］，而FST基因抑制表達(dá)也同樣引起二者表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)趨勢。其具體的相互作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

生肌決定因子（MyoD）是脊椎動物成肌過程的主要調(diào)控基因，對骨骼肌和肌細(xì)胞的形成和分化起重要的調(diào)控作用［12］。Matzuk等［13］發(fā)現(xiàn)，敲除了FST基因的小鼠出生時肌肉重量減少，這一結(jié)果與本研究的結(jié)果相符，F(xiàn)ST基因的表達(dá)抑制使得MyoD的表達(dá)出現(xiàn)了極顯著的下調(diào)，說明除了通過競爭性地結(jié)合MSTN 以外，F(xiàn)ST對骨骼肌發(fā)育的促進(jìn)作用

還存在更為復(fù)雜的調(diào)控途徑。

在本研究中，F(xiàn)R2-shRNA和FR3-shRNA干擾質(zhì)粒不僅沒有抑制FST基因的表達(dá)，還使得FST基因的表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)趨勢。在前人的研究中也出現(xiàn)過這種現(xiàn)象，Myostatin基因沉默導(dǎo)致的雙肌牛的肌肉組織中，Myostatin基因表達(dá)量高于正常的牛。這種現(xiàn)象被認(rèn)為機(jī)體為了維持該基因的正常表達(dá)，反饋性的提高基因表達(dá)量導(dǎo)致，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過RNA干擾技術(shù)成功獲得了穩(wěn)定抑制FST基因表達(dá)的豬胎兒成纖維細(xì)胞株，F(xiàn)ST基因表達(dá)顯著下調(diào)，并且導(dǎo)致了ActivinRⅡA、Myostatin、Bmp4和MyoD四個基因表達(dá)的變化，并極顯著地降低MyoD基因的表達(dá)。

［1］Shimasaki S, Koga M, Esch F, et al. Primary structure of the human follistatin precursor and its genomic organization［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85：4218-4222.

［2］Shimasaki S, Koga M, Esch F, et al. Porcine follistatin gene structure supports two forms of mature follistatin produced by alternative splicing［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1988, 152：717-723.

［3］Patel K. Follistatin［J］. Int J Biochem Cell Biol, 1998, 30：1087-1093.

［4］Kondo S, Hashimoto M, Murata EY, et al. Identification of the two types of specific receptor for activin/EDF expressed in Friend Ieukemia and embryonal carcinoma cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 161：1267-1272.

［5］Shiozaki M, Sakai R, Tabuchi M, et al. Evidence f or the particip ation of endogenous activin-A/erythroid differemtiation factor in the regulation of erythropoiesis［J］. Proc Acad Sci USA, 1992, 82：1553-1556.

［6］Hashimoto M, Nakamura T, lnoue S, et al. Follistatinis developmentally regulated cytokine in neural different iation［J］. Biol Chem, 1992, 267：7203-7206.

［7］Lee SJ, Lee YS, Zimmers TA, et al. Regulation of muscle mass by follistatin and activins［J］. Mol Endocrinol, 2010, 24（10）：1998-2008.

［8］Fire A, Xu S, Montgomeny MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans［J］. Nature, 1998, 391（6669）：806-811.

［9］張超, 羅艷梅, 張家驊, 等.激活素、抑制素及其受體與動物生殖作用的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38（2）：115-118.

［10］孫亞蒙, 張冬杰, 張旭, 等.卵泡抑素基因過表達(dá)對其通路上相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40（5）：35-40.

［11］Shimasaki S, Moore RK, Erickson GF, et al. The role of bone morphogenetic proteins in ovarian function［J］. Reprod Suppl, 2003, 61：323-337.

［12］Lee H, Habas R, Abate-Shen C. MSX1 cooperates with histone H1b for inhibition of transcription and myogenesis［J］. Science, 2004, 304（5677）：1675-1678.

［13］Matzuk MM, Lu N, Vogel H. Multiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin［J］. Nature, 1995, 374：360-363.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

FST-related Genes Expression in FST Gene Knock-down Pig Fetal Fibroblast Cells

Sun Yameng1Zhang Dongjie2Wang Liang2Zhang Xu1Yin Xue1Liu Di1，2
（1. College of Animal Sciences and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086）

In order to obtain FST gene knock-down pig fetal fibroblast cells and investigate the effects of related gene’s expression, the short hairpin RNA eukaryotic expression vectors for FST was constructed and transfected into pig fetal fibroblast cells. After screened with G418, transfected stable cell clones were obtained, and Real-time PCR was used to detect FST-related genes change in gene’s expression. The results showed that in stably transfected cell lines, FST gene expression was significantly inhibited, then resulting in the expression of ActivinRⅡA, Myostatin and Bmp4 downward trend, and the expression of MyoD gene very significantly reduced.

Follistatin（FST） RNA interference Porcine fetal fibroblast cells Related gene

2013-12-02

國家生豬產(chǎn)業(yè)體系崗位科學(xué)家項目（CARS-36）

孫亞蒙，男，博士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：symbuster_1986@163.com

劉娣，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：liudi1963@163.com