鞏健 宋健

（淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，淄博 255314）

轉(zhuǎn)染RNF6基因?qū)Ω伟┘?xì)胞IRS-2表達(dá)的影響

鞏健 宋健

（淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，淄博 255314）

構(gòu)建環(huán)指蛋白6（RNF6）真核表達(dá)載體，并探討其對胰島素受體底物1（IRS-2）表達(dá)的影響。以人cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RNF6 全長編碼基因，并將其克隆至載體pcDNA3.1-CHA中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2，利用Real time-PCR、Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)IRS-2 mRNA水平及蛋白表達(dá)情況。攜帶RNF6目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后IRS-2的mRNA表達(dá)降低，為對照組的37%，顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 RNF6引起IRS-2的表達(dá)下調(diào)，這一過程可能由于泛素化導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙。

胰島素受體底物-2 泛素化 環(huán)指蛋白6 胰島素

全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第5位。肝源性糖尿病是其一種常見的并發(fā)癥，外周胰島素抵抗是導(dǎo)致肝源性糖尿病的主要原因［1］。胰島素與其受體結(jié)合后，磷酸化胞內(nèi)胰島素受體底物（Insulin receptor substrate，IRS），從而產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)［2］。IRS-2作為一種船塢蛋白在胰島素/類胰島素生長因子信號通路中發(fā)揮非常重要的作用［3，4］。胰島素受體底物蛋白是胰島素經(jīng)典信號通路中的一個關(guān)鍵因子，參與調(diào)控胰島素受體后水平的許多生理過程。泛素化是胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾的重要方式，整個細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)（從細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到核膜等）都存在泛素化底物及其降解過程［5］。有研究［6，7］表明，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)去泛素化與泛素化過程與惡性腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，認(rèn)識理解此降解過程與分子機(jī)制，對治療由泛素系統(tǒng)功能紊亂引起的各種疾病具有重要作用。泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2 和泛素連接酶E3共同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)泛素化反應(yīng)，其中連接酶E3能特異識別相關(guān)底物，由此決定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）蛋白降解的特異性，所以連接酶E3引起科研工作者的廣泛關(guān)注［8］。環(huán)指蛋白6（Ring finger protein 6）作為泛素連接酶E3，結(jié)合E2從而降解相應(yīng)靶蛋白［8］。因此，本研

究構(gòu)建人RNF6全長基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2研究RNF6對IRS-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2由中科院上海生命科學(xué)研究院提供；pcDNA3.1載體、DNA連接酶、EcoR I和BamH I均購自TaKaRa公司；4XdNTP、TaqDNA聚合酶購自美國Promega公司；Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天；質(zhì)粒提取、RNA提取及膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司；Marker-DL2000購自上海生工；HRP標(biāo)記的β-actin內(nèi)參購自上?？党缮?；Anti-IRS-2抗體購自美國Upstate公司；羊抗兔IgG二抗購自美國SouthernBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 針對人RNF6的序列設(shè)計并合成PCR 引物，在引物序列中分別添加Hind III酶切位點（引物1：5'- ATC AAGCTTatgaatcagtctagatcga- 3'）和SalI酶切位點（引物2：5'-ATC GTCGACcccattgtttgctatgttag- 3'），以人cDNA為模板擴(kuò)增RNF6，PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，50℃復(fù)性15 s，68℃延伸15 s，30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA-CHA分別用Hind III、SalI雙酶切，酶切產(chǎn)物凝膠回收純化后用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α擴(kuò)增，涂布LB瓊脂平板后37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆再在LB試管中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按試劑盒說明書抽提質(zhì)粒，用Hind III、SalI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送去上海生工進(jìn)行測序。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 在含CO25%、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2，每隔1-2 d傳代一次。按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。試驗細(xì)胞分為3組：即空白對照組（不做任何處理的HepG2）、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 Real-time PCR 檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 以各組cDNA為模板，加入緩沖液引物等進(jìn)行PCR，各樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，94℃ 30 s，60℃退火30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)，72℃ 7 min。PCR結(jié)束后加入上樣緩沖液后對產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)定量PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot檢測 IRS-2蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用蛋白裂解液處理細(xì)胞提取蛋白樣品，蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE分離后，恒流200 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入相應(yīng)的一抗、二抗進(jìn)行孵育并洗膜，ECL試劑發(fā)光檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 統(tǒng)計分析 相關(guān)數(shù)據(jù)處理運用SPSS17.0，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示計量資料，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲取

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，在約2 000 bp處有目的條帶，目的片段大小與預(yù)期擴(kuò)增的基因片段大小一致，見圖1。

圖1 目的基因RNF6的PCR擴(kuò)增

2.2 陽性克隆的鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli.DH5α，篩選陽性克隆后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行Hind III和SalI雙酶切鑒定和RT-PCR檢測RNF6基因表達(dá)情況。圖2顯示重組質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)生目的條帶和pcDNA-CHA載體部分條帶，證明人RNF6的cDNA序列已插入表達(dá)載體pcDNACHA中。RT-PCR檢測（圖3）顯示，與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，陽性克隆穩(wěn)定高表達(dá)RNF6 mRNA。

圖2 重組pcDNA-CHA-RNF6載體的雙酶切鑒定

圖3 轉(zhuǎn)染RNF6 后HepG2細(xì)胞IRS-2 mRNA表達(dá)的變化

2.3 Real time PCR、Western blot檢測 IRS-2的表達(dá)情況

試驗結(jié)果如圖4所示，攜帶RNF6的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后HepG2細(xì)胞中IRS-2的mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.01），為對照組的37%。蛋白表達(dá)情況如圖5所示，在RNF6轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，IRS-2蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01），空白對照與空載質(zhì)粒IRS-2表達(dá)不變。

圖4 轉(zhuǎn)染RNF6 后HepG2細(xì)胞IRS-2 mRNA表達(dá)的變化

圖5 Western blot檢測IRS-2表達(dá)

3 討論

RNF6 是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的一種E3連接酶，基因序列全長2 058 bp，能編碼685個氨基酸，包括C-端的RING-H2指結(jié)構(gòu)和N端的螺旋結(jié)構(gòu)域。研究表明［9］，RNF6通過C-端的RING-H2指結(jié)構(gòu)誘發(fā)腎上腺受體（AR）的非水解泛素化而穩(wěn)定AR，進(jìn)而招募ARA54上調(diào)AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性。在糖尿病、胰島素抵抗時，肝臟、胰腺、肌肉和脂肪組織均出現(xiàn)異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］。有研究表明［11-13］，胞內(nèi)蛋白降解除溶酶體途徑外，還有細(xì)胞凋亡過程中的caspases 途徑，以及降解大部分短周期壽命蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；選擇性降解某種蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、抗原呈遞及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種生命過程；胰島素信號相關(guān)蛋白的異常降解在糖尿病發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

本試驗從cDNA 文庫中擴(kuò)增出人RNF6基因的全長序列，并將其構(gòu)建到pcDNA3.1-CHA 真核表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，實時定量PCR檢測到IRS-2基因的mRNA水平明顯降低。有研究表明，機(jī)體內(nèi)胰島素高濃度或長期高水平表達(dá)，可通過胰島素生長因子-1受體活化絲氨酸激酶，磷酸化Ser/Thr，進(jìn)而抑制酪氨酸激酶活性磷酸化Tyr［14］。Pederson等［15］研究證實，Ser/Thr磷酸化后的IRS-1，空間構(gòu)象改變易與泛素共價結(jié)合，進(jìn)而被蛋白酶體降解。本研究結(jié)果顯示，泛素連接酶RNF6

下調(diào)靶蛋白IRS-2表達(dá)水平，但是否確實由于泛素化作用引起IRS-2基因表達(dá)下調(diào)，有待進(jìn)一步驗證。由于泛素化下調(diào)的IRS-2可能導(dǎo)致胰島素信號通路障礙，是導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制，泛素化相關(guān)信號蛋白將是研究糖尿病治療藥物的新靶點。

4 結(jié)論

本研究以人cDNA為模板，成功構(gòu)建RNF6基因全長編碼序列真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CHA-RNF6轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞株48 h后，使HepG2細(xì)胞IRS-2表達(dá)顯著下調(diào)，這一過程可能會由于RNF-6的泛素化作用導(dǎo)致胰島素信號通路障礙。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effect of Gene Ring Finger Protein 6 on the Expression of Insulin Receptor Substrate-2 in Hepatoma Cells

Gong Jian Song Jian
（Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Zibo Vocational Institute，Zibo 255314）

It was to construct an eukaryotic expression vector of ring finger protein 6（RNF6）gene and investigate the effect of RNF6 on the expression of insulin receptor substrate-2（IRS-2）. The coding sequence of hRNF6 gene was amplified by PCR with human cDNA as template. The pcDNA3.1-CHA-RNF6 was constructed and transfected into hepatocarcinoma cells（HepG2）by routine mole cular biology technology. The total RNA was extracted from HepG2 cells 72 hours post-transfection, the expression levels of IRS-2 was detected by real-time quantitative PCR. Western blotting was applied to detect the protein levels of IRS-2. Result showed that the mRNA level of IRS-2 gene in transfected HepG2 was 37% of the control. The expression level of IRS-2 was lower than the control group significantly（P<0.01）. The expression of IRS-2 was down-regulated in HepG2 significantly, and the disorder in insulin signal transduction pathway, which may result from enhanced ubiquitylation level of IRS-2.

Insulin receptor substrate-2 Ubiquitin RNF6 Insulin

2013-12-25

鞏健，女，副教授，研究方向：生物技術(shù)應(yīng)用；E-mail：ghfh2008@126.com