王玉亭 周垂賢 王道奎 王金鵬 秦時(shí)強(qiáng)

山東省濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濰坊261021

血管生成素-2及血管內(nèi)皮細(xì)胞因子在星形細(xì)胞瘤中表達(dá)情況及其相關(guān)性研究

王玉亭 周垂賢 王道奎▲王金鵬 秦時(shí)強(qiáng)

山東省濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濰坊261021

目的研究血管生成素.2(Ang.2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其與星形細(xì)胞瘤惡性程度之間的相關(guān)性。方法采用免疫組化方法檢測(cè)60例人腦星形細(xì)胞瘤和12例健康腦組織中Ang.2及VEGF蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析，分析它們的表達(dá)情況和相關(guān)性。結(jié)果60例星形細(xì)胞瘤組織中有39例(65.00%)出現(xiàn)Ang.2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，35例(58.33%)出現(xiàn)VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)；其陽(yáng)性表達(dá)率均高于健康腦組織(16.67%、16.67%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著星形細(xì)胞病理分級(jí)的提高，Ang.2及VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ang.2與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.8649，P＜0.05)。結(jié)論Ang.2和VEGF的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤惡性程度密切相關(guān)，且在星形細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

星形細(xì)胞瘤；血管生成素-2；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

星形細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系最常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的60%［1］，預(yù)后不良。星形細(xì)胞瘤無(wú)論分化高低均在腦內(nèi)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，星形細(xì)胞瘤的發(fā)生和侵襲是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，眾多研究已表明腫瘤血管形成在星形細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)及浸潤(rùn)中起重要作用。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素(angiopoietin，Ang)作為新的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，共有4個(gè)亞型，包括Ang.1、 Ang.2、Ang.3、Ang.4，目前對(duì)Ang.1、Ang.2的研究較深入，尤其是Ang.2在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于周?chē)＝M織，且特異表達(dá)于腫瘤邊緣的血管重建區(qū)，在腫瘤早期血管增生、維持及后期血管增生延續(xù)的惡性循環(huán)中起重要作用［2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種多功能的細(xì)胞因子，其作用包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高血管的通透性、促進(jìn)血管支持物的生成、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等。

Ang.2及VEGF在其他腫瘤中的相關(guān)性已有不少研究，但在星形細(xì)胞瘤中尚未研究，本研究主要研究其在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況以及它們之間的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本60例，取自濰坊市人民醫(yī)院腦科醫(yī)院神經(jīng)外科2008年1月～2009年10月手術(shù)患者的存檔蠟塊，均經(jīng)病理證實(shí)?；颊咝g(shù)前均未接受放療和化療，年齡為5～73歲，平均(38.2±7.1)歲，其中，＜40歲27例(45%)，≥40歲33例(55%)；男35例，女25例，男女比例為1.4∶1；腫瘤位于幕上者39例，幕下者21例；腫瘤＞3 cm者19例，≤3 cm者41例；腫瘤全切46例(76.7%)，腫瘤部分切除14例(23.3%)；術(shù)前卡氏(KPS)評(píng)分＞70分49例(81.7%)，KPS評(píng)分＜70分11例(18.3%)。選擇顱內(nèi)深部腫瘤切除術(shù)時(shí)表淺的腦組織12例作為對(duì)照，經(jīng)病理證實(shí)均為健康腦組織；其中，男7例，女5例；額葉4例，頂葉2例，顳葉4例，小腦2例。

參照WHO(2000年)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將患者分為四組：Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)15例，Ⅳ14例。為了便于統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和分析，將Ⅰ、Ⅱ級(jí)歸為低度惡性腫瘤，Ⅲ、Ⅳ歸為高度惡性腫瘤。

1.2 試劑

一抗：鼠抗人Ang.2單克隆抗體(即用型，定位于細(xì)胞漿)；鼠抗人VEGF單克隆抗體(即用型，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿)；二抗：通用型PV.6000二步法免疫組化試劑盒。均由京中杉金橋生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 蠟塊制備和組織制片

組織標(biāo)本用10%中性甲醛固定，酒精脫水，用二甲苯將標(biāo)本做透明處理，并于溫箱內(nèi)將透明組織溶于石蠟內(nèi)，常規(guī)石蠟包埋，用切片機(jī)制作4 μm切片標(biāo)本。

1.3.2 免疫組化方法

將石蠟切片脫蠟，水化組織切片，用3%H2O2去離子水孵育5 min，滴加抗體，應(yīng)用DAB溶液顯色，再用蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片，完成免疫組化PV. 6000二步法。在光學(xué)顯微鏡下，以背景無(wú)顏色，細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜內(nèi)被染成棕黃色顆粒作為Ang.2、VEGF蛋白陽(yáng)性染色(即為陽(yáng)性細(xì)胞)，每張切片觀察300個(gè)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 結(jié)果判斷

1.3.3.1 Ang.2蛋白染色結(jié)果判定參照相關(guān)文獻(xiàn)［3.4］采取半定量計(jì)數(shù)法進(jìn)行評(píng)判，即在高倍鏡(400×)下隨機(jī)記錄5個(gè)視野，按著色細(xì)胞染色強(qiáng)弱計(jì)分：陰性為0分，弱陽(yáng)性(淡黃色)為1分，陽(yáng)性(黃色)為2分，強(qiáng)陽(yáng)性(棕黃色)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：＜10%為0分，10%～＜30%為1分，30%～＜50%為2分，≥50%為3分。根據(jù)這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分之和分為4級(jí)：0分為(.)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。

1.3.3.2 VEGF蛋白染色結(jié)果判定參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］采取半定量計(jì)數(shù)法進(jìn)行評(píng)判，染色強(qiáng)度得分標(biāo)準(zhǔn)為：陰性為0分，弱陽(yáng)性(淡黃色)為1分，陽(yáng)性(黃色)為2分，強(qiáng)陽(yáng)性(棕黃色)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：＜5%計(jì)0分，5%～＜25%計(jì)1分，25%～＜50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分。上述兩項(xiàng)分值相加得0分為(.)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-2蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和健康腦組織中的表達(dá)

本研究中，健康腦組織與星形細(xì)胞瘤中Ang.2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.67%(2/12)和65.00%(39/ 60)，Ang.2在星形細(xì)胞瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于健康腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。高級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中(Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí))Ang.2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 血管生成素2蛋白在不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況（例）

2.2 VEGF蛋白在星形細(xì)胞瘤和健康腦組織中的表達(dá)

本研究中，健康腦組織與星形細(xì)胞瘤中VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.67%(2/12)和58.33%(35/ 60)，星形細(xì)胞瘤組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于健康腦組織(P＜0.05)。高級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中(Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí))VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 Ang-2與VEGF蛋白表達(dá)等級(jí)相關(guān)分析

Ang.2蛋白的表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)均呈顯著正相關(guān)性(r=0.8649，P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白在不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況（例）

表3 Ang-2蛋白與VEGF蛋白表達(dá)相關(guān)性情況（例）

3 討論

3.1 Ang-2在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用

Ang.2屬于酪氨酸激酶受體Tie.2的配基之一。Ang.2與Tie.2結(jié)合，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管生成。Ahmad等［6］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Ang.2的移植瘤體積明顯增大，血管密度增加，提示Ang.2有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。目前關(guān)于腫瘤生長(zhǎng)的最新觀點(diǎn)認(rèn)為［7］，腫瘤生長(zhǎng)的早期，腫瘤細(xì)胞與宿主共擇并形成一個(gè)血供較好的血管區(qū)，但這些血管并不隨腫瘤的生長(zhǎng)而增生，而是發(fā)生了退化，Ang.2此時(shí)也表達(dá)增多。其可能的原因是由于瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快，代謝能力強(qiáng)于健康組織，此時(shí)機(jī)體自分泌Ang.2進(jìn)行“自殺性防御”，破壞被腫瘤組織占據(jù)的血管，以達(dá)到阻止腫瘤生長(zhǎng)的目的。此時(shí)腫瘤組織表現(xiàn)為血管退化，腫瘤細(xì)胞凋亡，組織壞死。之后，邊緣殘余的腫瘤細(xì)胞為了生存，在缺氧的環(huán)境下，生成大量的VEGF。

Ang.2對(duì)新生毛細(xì)血管的作用主要表現(xiàn)在，Ang.2一開(kāi)始通過(guò)拮抗Ang.1而破壞腫瘤血管，同時(shí)也松解了血管結(jié)構(gòu)，消除血管基底膜和周?chē)?xì)胞對(duì)血管形成的限制，并激活了內(nèi)皮細(xì)胞。之后，在殘余腫瘤細(xì)胞大量分泌VEGF的情況下，對(duì)VEGF較敏感的內(nèi)皮細(xì)胞便迅速發(fā)生增殖、侵襲和遷徙，新生血管開(kāi)始芽生。但由于Ang.2的持續(xù)高表達(dá)拮抗了Ang.1的作用，所以新生的腫瘤血管壁不完整，且滲透性高［8］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Ang.2、VEGF均在星形細(xì)胞瘤中呈高陽(yáng)性表達(dá)(65.00%，58.33%)，且其二者具有高度相關(guān)性(r=0.8649)也佐證了這一點(diǎn)。Holash等［9］建立了鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)在腫瘤直徑＞1 mm時(shí)，腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞Ang.2可強(qiáng)表達(dá)；當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)壞死時(shí)，在壞死中央的腫瘤血管見(jiàn)Ang.2強(qiáng)表達(dá)，在邊緣腫瘤中亦可見(jiàn)Ang.2呈強(qiáng)表達(dá)。Koga等［10］研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有Ang.2表達(dá)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤Ang.2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度均高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤。這與本文研究顯示的惡性程度高的星形細(xì)胞瘤組織Ang.2蛋白表達(dá)明顯高于惡性程度低的星形細(xì)胞瘤組織的表達(dá)相一致。

3.2 VEGF在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用

VEGF是一種多功能的細(xì)胞因子。近來(lái)研究表明，VEGF是新生血管形成的中心調(diào)控因子，其主要功能包括：①增加腫瘤細(xì)胞的血供。由于腫瘤細(xì)胞在快速生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)的需求量過(guò)大，易導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)缺血缺氧，而缺氧恰為VEGF最強(qiáng)烈的誘導(dǎo)劑，因而導(dǎo)致VEGF大量分泌，并特異性與VEGF受體相結(jié)合，加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和分化，促使新生血管生成，以滿(mǎn)足腫瘤生長(zhǎng)的需求。腫瘤的惡性程度越高、體積越大、轉(zhuǎn)移范圍越廣及浸潤(rùn)程度越深，則對(duì)氧的需求越高，故VEGF的分泌越多，并且二者呈正相關(guān)［11］。②VEGF可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞基因，增強(qiáng)尿激酶型纖溶酶原激活物和組織型纖溶酶原激活物，并減弱纖溶酶原激活劑抑制物(PAI.1)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)血管的形成［12］，改善癌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和氧的需求。③VEGF促使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶.9(MMP.9)，使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，激活明膠酶原A降解原來(lái)的基膜，促使血管形成［13.14］，使腫瘤營(yíng)養(yǎng)和氧供給加大。④VEGF可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)蛋白及磷酸肌酶途徑增強(qiáng)一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)，導(dǎo)致一氧化氮生成增多，進(jìn)而促進(jìn)新生血管網(wǎng)建立和管腔的形成［15.16］。大量研究證實(shí)，VEGF及其受體在大多數(shù)人的腫瘤細(xì)胞分泌和表達(dá)，它通過(guò)不同的途徑供應(yīng)腫瘤營(yíng)養(yǎng)。Vlom等［17］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中VEFG高表達(dá)，并證實(shí)了腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生VEGF，VEGF的旁分泌機(jī)制和腺、鱗癌組織中VEGF表達(dá)程度不同。索新等［18］也發(fā)現(xiàn)，VEGF在人腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，VEGF在星形細(xì)胞瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.33%，明顯高于正常腦組織，并且隨著腫瘤組織病理級(jí)別的升高陽(yáng)性率逐漸上升。這說(shuō)明VEGF在星形細(xì)胞瘤的血管形成中起著重要作用。

總之，本研究結(jié)果表明Ang.2及VEGF在星形細(xì)胞瘤中發(fā)生及惡化過(guò)程中起重要作用，可根據(jù)其在血管和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的實(shí)事，使它作為預(yù)測(cè)星形細(xì)胞瘤預(yù)后的標(biāo)志物在腫瘤血管的分子靶向治療上發(fā)揮作用成為可能。

［1］王忠誠(chéng).神經(jīng)外科學(xué)［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998：397.

［2］Fiedler U，Krissl T，Koidl S，et al.Angiopoietin.1 and angiopoietin.2 share the same binding domains in the Tie.2 receptor involving the first I g.like loop and the epidermal growth factor like repeats［J］.J Biol Chem，2003，278 (3)：1721.

［3］Volm M，Koomagi R，Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt.1 in squamous cell lung cancer［J］.Int J Cancer，1997，74：64.68.

［4］李超，馮紅超，宋宇峰.口腔鱗癌中促血管生成素.2的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及血管生成的關(guān)系［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(3)：131.133.

［5］Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis：a new significant independent prognostic indicator in early. stage breast carcinoma［J］.Natl Cancer Inst，1992，84(9)：1875.1887.

［6］Ahmad SA，Liu W，Jung YD，et al.The effects of angiopoietin.1 and.2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer［J］.Cancer Res，2001，61(4)：1255.1259.

［7］Yancopoulos GD，Davis S，Gale NW，et al.Vascular.spe. eifie growth factors and blood vessel formation［J］.Nature，2000，407(6801)：242.248.

［8］陳海紅，吳求亮.血管生成素2的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2005，2(2)：129.131.

［9］HolashJ，MaisonpierrePC，ComptonD，etal.Vesselcooption，regression，and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF［J］.Science，1999，284(5422)：1994.1998.

［10］Koga K，Todaka T，Morioka M，et al.Expression of angiopoietin.2 in human glioma cells and its role for angiogenesis［J］.Cancer Res，2001，61(15)：6248.

［11］Akhashi Y，Bueana CD，Clearly KR，et al.P53 vessel count and vascular endothelial growth factor expression in human colon cancer［J］.Int J Cancer，1998，79：34.38.

［12］Ferrara N，Houck K，Jackman L，et al.Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins［J］.Endocr Rev，1992，13：18.32.

［13］Zucker S，Mirza H，Conner CE，et al.Vascular endothelial growth factor induces tissue factor and matrix metal oproteinase production in endothelial cells：convertion of prothrombin to thrombin results in progelatinase A activation and cell proliferation［J］.Int J Cancer，1998，75(5)：780.786.

［14］盧保霞.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子治療缺氧缺血性腦損傷的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(15)：2353.2355.

［15］王魯，湯釗酞.一氧化氮的產(chǎn)生與腫瘤血管形成［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊(cè)，1999，26(5)：262.

［16］王志平.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子受體與息肉病變的相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(6)：827. 830.

［17］Volm M，Koomagi R，Mattern J，et al.PD.ECGF，F(xiàn)GF and VEGF expression in non small cell lung carcinomas and their association with lymph node metastasis［J］.Anticancer Res，1999，19(1)：65.112.

［18］索新，郭永川，孟令秋，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在人腦膠質(zhì)瘤的定位及表達(dá)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21(9)：1100.1102.

Expression and correlation study of angiogenin-2 and vascular endotheliai growth factor in astrocytoma

WANG YutingZHOU ChuixianWANG Daokui▲WANG JinpengQIN ShiqiangDepartment of Neurosurgery,Weifang People's Hospital,Shandong Province,Weifang261021,China

Objective To study the expressions of angiogenin.2（Ang.2）and vascular endotheliaI growth factor（VEGF）in astrocytoma and their correlations with the grade malignancy of astrocytoma.Methods The expressions of Ang.2 and VEGF from astrocytoma in 60 patients and from 12 cases of healthy brain tissues were detected by immunohistochemical method.Data from the experiment were analyzed by SPSS 10.0 using chi.square and Spearman rank correlation,in order to observe the expression and correlation.Results Among 60 patients with astrocytoma,there were 39 cases（65.00%）with Ang.2 protein in positive expression and 35 cases（58.33%）with VEGF protein in positive expression.The positive expression rates in astrocytoma tissue were both higher than those in the healthy brain tissue（16.67%,16.67%）, which displayed significant differences（P＜0.05）.With pathological grading of astrocyte advancing,the positive expression rates of Ang.2 and VEGF gradually increased with statistical difference（P＜0.05）.In addition,there was positive correlation between Ang.2 and expression of VEGF（r=0.8649,P＜0.05）.Conclusion Expressions of Ang.2 and VEGF are closely related with the grade malignancy of astrocytoma,and they play important roles in the occurrence and development of astrocytoma.

Astrocytoma;Angiogenin.2;Vascular endotheliai growth factor

R730.231

A

1673-7210（2014）02（a）-0013-04

2013.11.28本文編輯：程銘)

山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)20112007)。

▲通訊作者