薄 冰

(河南大學(xué)體育學(xué)院運動人體科學(xué)教研室，河南開封475000)

竇房結(jié)作為心臟的首要起搏點，在心臟規(guī)律的電學(xué)活動中具有極其重要的作用［1］，其中，快激活延遲整流鉀離子通道(IKr通道)引導(dǎo)竇房結(jié)細胞主要的復(fù)極化電流，該通道功能活動的改變可影響竇房結(jié)細胞動作電位復(fù)極化，進而導(dǎo)致竇房結(jié)功能障礙［2-3］。目前，關(guān)于運動對竇房結(jié)細胞IKr通道的影響鮮見報道，本文在跑臺訓(xùn)練大鼠模型上，探討IKr通道亞基ERG1b 基因表達及通道電流密度變化，揭示運動對于竇房結(jié)離子通道及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

SPF 級雄性SD 大鼠50 只，6 周齡，體質(zhì)量180±8 g(由河南省實驗動物中心提供，合格證號:410118)。動物常規(guī)分籠飼養(yǎng)，5 只/籠，國家標(biāo)準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18 ±2 ℃，相對濕度為40%～50%，光照時間12 h。大鼠首先進行3 d 適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，速度10 m/min，時間20 min，跑臺坡度為0°。訓(xùn)練結(jié)束后，將能夠完成跑臺訓(xùn)練的大鼠隨機分為5 組，每組10 只，包括對照組(C 組)1 組、1 次力竭組(O 組)2 組、兩周反復(fù)力竭組(R 組)2 組。C 組大鼠不進行任何運動訓(xùn)練，O 組大鼠在正常飼養(yǎng)兩周后，進行1 次速度25 m/min，坡度為0°跑臺訓(xùn)練至力竭，R 組運動方式及強度同O組，每天1 次跑臺訓(xùn)練，每周6 d，共訓(xùn)練2 周。跑臺訓(xùn)練組大鼠分別于訓(xùn)練結(jié)束后0 h 及24 h 取材，O組以O(shè)-0 h 及O-24 h 命名，R 組以R-0 h 及R-24 h命名［4］。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 檢測mRNA:腹腔注射10%水合氯醛(1 mL/100 g 體質(zhì)量)麻醉大鼠，參照文獻分離竇房結(jié)組織［5-6］，Trizol 法提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄RNA 合成為cDNA，保存于－20 ℃?zhèn)溆茫?］。

通過互聯(lián)網(wǎng)GenBank 查找基因序列，應(yīng)用Primer5 軟件進行引物設(shè)計，設(shè)計完成的引物由Invitrigin公司合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR 基因引物序列Table 1 Sequence of primers for real-time PCR

取實時熒光定量PCR 專用96 孔板，解凍引物和cDNA，依次加入:引物F/R(上下游引物終濃度均為10 μmol/ L)1 μL、相對應(yīng)的cDNA 1 μL，RealqPCR Master Mix 12 μL、H2O 11 μL，共25 μL，封膜。預(yù)熱ABI7900HT 定量PCR 儀，進行實時熒光定量PCR 實驗，反應(yīng)條件如下:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min(生成擴增曲線);95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s(生成熔解曲線)，上述反應(yīng)共40 個循環(huán)［7-9］。觀察熔解曲線，判斷PCR 特異性;以2－△△Ct作為計算公式，分析各組間mRNA 的表達差異，每個反應(yīng)重復(fù)3 次。

1.2.2 Western blot 檢測蛋白質(zhì)表達:采用Novagen跨膜蛋白提取試劑盒按說明書操作提取大鼠竇房結(jié)組織跨膜蛋白(Cat No.71772-3)。提取蛋白質(zhì)后，加入2 ×SDS 上樣緩沖液煮沸，10% SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。取下膜，用5% BSA 室溫封閉1 h，TBST(洗滌緩沖液)洗膜5 min 后加入稀釋濃度為1∶1 000 的一抗(兔ERG 多克隆抗體，Cat.No.ab92513)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 ×5 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 ×5 min。在暗室中，取ECL 顯色液A、B 液等體積混合，將轉(zhuǎn)印膜用混合液潤濕均勻，壓在暗盒中固定，顯影定影3 min。用掃描儀進行膠片掃描，圖像分析采用Quantity one 軟件進行吸光度積分值分析。

1.2.3 大鼠竇房結(jié)細胞膜IKr通道電流密度測定:參照文獻［10］，急性分離大鼠心臟竇房結(jié)細胞(圖1)，選取大鼠單個竇房結(jié)細胞為研究對象，采用全細胞膜片鉗記錄大鼠竇房結(jié)細胞IKr電流(圖6)，具體操作步驟參照文獻［8-9］。實驗結(jié)果以通道電流密度數(shù)值表示，電流密度為電流強度與膜電容的比值(pA/pF)，其中電流強度為實驗所測量電流峰值，膜電容為實驗中記錄到的單個細胞電容值。

圖1 酶消化分離后不同形態(tài)大鼠竇房結(jié)細胞Fig 1 Morphlolgy of isolated mouse sinoatrial node cells(scale bar=10 μm)

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IKr通道亞基ERG1b mRNA 表達

與C 組相比，O-0h 組ERG1b mRNA 相對表達量升高(P＜0.01)，O-24 h 組無變化;R-0 h 及R-24 h組表達量下降，低于C 組及O-0 h(P＜0.01，P＜0.01)，兩組間無明顯差異(圖2，3)。

圖2 各組大鼠竇房結(jié)ERG1b real-time PCR 熔解曲線Fig 2 The dissociation curve of ERG1b real-time PCR of different groups in sinoatrial node

圖3 大鼠竇房結(jié)IKr通道亞基ERG1b mRNA相對表達量比較Fig 3 ERG1b mRNA expression level in IKr channel of rats sinoatrial node(±s，n=8)

2.2 IKr通道亞基ERG1b 蛋白質(zhì)表達

與C 組相比，一次跑臺訓(xùn)練組吸光度值無明顯差異;與C 及O-0h 組相比，R-0h 及R-24 h 組吸光度值明顯下降(P＜0.01，P＜0.01)(圖4，5)。

2.3 各組大鼠竇房結(jié)IKr通道電流密度

與對照組相比，O-0 h 及O-24 h 組電流密度無明顯變化，R-0h 及R-24 h 組電流密度較對照組及一次訓(xùn)練兩組明顯下降(P＜0.01)(表2，圖6，7)。

圖4 各組大鼠竇房結(jié)IKr通道亞基ERG1b蛋白質(zhì)表達電泳圖Fig 4 The electrophoresis of ERG1b protein expression level in IKr channel of rats sinoatrial node

圖5 各組大鼠竇房結(jié)IKr通道亞基ERG1b 蛋白質(zhì)表達量比較Fig 5 ERG1b protein expression level in IKr channel of rats sinoatrial node (±s，n=8)

表2 各組大鼠竇房結(jié)細胞IKr通道電流密度Table 2 The current density of IKr channel of different groups in sinoatrial node cells

3 討論

圖6 C 組及R-0 h 組大鼠竇房結(jié)細胞IKr原始電流圖Fig 6 IKr original traces of different groups in sinoatrial node cells IKr

圖7 對照組、一次力竭即刻組、反復(fù)力竭即刻組大鼠竇房結(jié)細胞膜上IKr通道IKr I-V 曲線Fig 7 IKr current-voltage (I-V)relationship of different groups in sinoatrial node cells

快激活I(lǐng)Kr通道在竇房結(jié)細胞動作電位復(fù)極化過程中引導(dǎo)外向K+電流，在動作電位復(fù)極化控制及起搏活動中發(fā)揮重要作用，構(gòu)成心臟竇房結(jié)IKr通道主要為ERG1b 基因［11］。本研究用兩周跑臺訓(xùn)練的大鼠模型探討運動對大鼠竇房結(jié)IKr通道亞基ERG1b 基因表達及通道IKr電流密度的影響，發(fā)現(xiàn)一次跑臺訓(xùn)練對ERG1b 基因表達無明顯影響，兩周力竭訓(xùn)練后該亞基mRNA 及蛋白質(zhì)表達量減少，運動結(jié)束后24 h 內(nèi)其變化趨勢穩(wěn)定，可見，兩周反復(fù)大強度運動能夠抑制ERG1b 基因表達，這種下調(diào)可能引起IKr通道介導(dǎo)的IKr電流密度減少，結(jié)合電生理實驗結(jié)果可知，R-0 h 組電流密度較對照組明顯下降，并且在運動結(jié)束后24 h 無明顯變化，這與ERG1b 基因表達的變化趨勢類似，提示ERG1b 亞基的變化與IKr通道的變化密切相關(guān)，反復(fù)力竭運動對于IKr通道亞基基因表達及電流密度均可產(chǎn)生抑制作用。

有報道納摩爾劑量的E-4031 阻斷兔竇房結(jié)自律細胞中IKr后，可使細胞的靜息電位穩(wěn)定于－30 mV和－40 mV 之間，最大舒張電位的正向變化可減少起搏電流If 的活化，同時增加電壓依賴性ICa，L和ICa，T在舒張期去極化的失活，導(dǎo)致動作電位幅度和上升速度減少，從而引起起搏活動的減慢并終止竇房結(jié)細胞的自律活動［12］。

本研究證實，反復(fù)力竭運動可引起大鼠竇房結(jié)細胞膜IKr通道亞基ERG1b 基因表達及IKr電流密度下降，這可能成為運動引發(fā)竇房結(jié)功能障礙及運動性猝死發(fā)生的離子通道機制之一［13］。

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