杜迎春鄭家地

39例足癬復(fù)發(fā)后病原菌核糖體基因序列變化

杜迎春1鄭家地2

目的: 檢測紅色毛癬菌足癬復(fù)發(fā)后致病菌株基因型的變化。方法: 對39例紅色毛癬菌足癬復(fù)發(fā)后進(jìn)行紅色毛癬菌核糖體保守區(qū)(部分5.8s和ITS－2)和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS－1,TRS－2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,基因序列測定。結(jié)果: 39株紅色毛癬菌復(fù)發(fā)前后和標(biāo)準(zhǔn)株保守區(qū)基因序列測定比較,同源性均達(dá)99%,均為紅色毛癬菌；(NTS)內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS－1,TRS－2)基因序列測定比較,其中3株菌TRS－1區(qū)存在個(gè)別堿基突變,3株TRS－1區(qū)存在重復(fù)序列拷貝數(shù)變異,1株菌TRS－2區(qū)存在個(gè)別堿基突變。結(jié)論: 復(fù)發(fā)后的紅色毛癬菌基因型基本穩(wěn)定,說明足癬復(fù)發(fā)大部分與原淺表真菌復(fù)燃有關(guān)。

足癬； 紅色毛癬菌； 核糖體非保守區(qū)； 基因序列測序

足癬是一類最常見的真菌感染性疾病,具有傳染性、發(fā)病率高、易復(fù)發(fā)和再感染的特點(diǎn),雖不危及生命,但對患者的生活質(zhì)量有不同程度的影響。本研究將39例紅色毛癬菌所致足癬復(fù)發(fā)前后的核糖體非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)NTS內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS1,TRS2)及保守區(qū)(部分5.85和ITSZ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,序列測定,比較其變化,從而探討復(fù)發(fā)足癬感染是原紅色毛癬菌復(fù)燃,還是新的淺表真菌感染。

1 材料和方法

1.1 一般資料 39例足癬患者均來自2012年7～9月廈門市中醫(yī)院皮膚科,取皮損處皮屑鏡檢及培養(yǎng)后經(jīng)菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)均鑒定為紅色毛癬菌,并進(jìn)行貯藏、保存。同時(shí)跟蹤隨訪患者,次年再次復(fù)發(fā)者再取其皮屑進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。

1.2 菌株的培養(yǎng)與保存 (1)培養(yǎng)與保存:將兩次取得的菌株分別進(jìn)行培養(yǎng),采用SDA試管培養(yǎng)基,放入電熱恒溫培養(yǎng)箱(27℃),共2周。(2)保存:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周后,置于室溫下保存,每3個(gè)月向試管內(nèi)加少許無菌蒸餾水,用膠帶將試管口密封。

1.3 DNA的提取及純化 取培養(yǎng)的菌體放入無菌研缽中,用足量的液氮將其研至粉末狀,進(jìn)行提取與純化。用煮沸凍融法結(jié)合經(jīng)典酚氯仿法1,2制備高樣本。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定

1.4.1 擴(kuò)增部分5.8S和ITS－2區(qū)PCR反應(yīng)體系TaKaRa ExTaq 0.25μL(5 U/μL),10×ExTaq Buffer 5 μL,dNTP混合液4μL(2.5mmol/L),引物各2μL(10 pmol),模板(基因組DNA)1μL,滅菌ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min后30個(gè)循環(huán): 94℃30 s,60℃30 s,72℃1 min；繼之72℃延伸7 min。取5μL產(chǎn)物0.9%瓊脂糖電泳。

1.4.2 擴(kuò)增TRS－1,TRS－2區(qū)PCR反應(yīng)體系 TaKa-Ra ExTaq 0.25μL(5 U/μL),10×ExTaq Buffer 5μL,dNTP混合液4μL(2.5 mmol/L),引物各2μL(10 pmol)模板DNA 1μL,滅菌12 ddH2O補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)條件:TRS－1區(qū):94℃預(yù)變性2 min后30個(gè)循環(huán):94℃30 s,58℃30 s,72℃1min；繼之72℃延伸7 min。TRS－2區(qū):94℃預(yù)變性1 min后30個(gè)循環(huán): 94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min；繼之72℃延伸7 min。各取5μL產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳。

1.5 PCR產(chǎn)物的純化 采用北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心的DNA快速純化/回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.6 測序 純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用BLAST軟件比較分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株核糖體保守區(qū)(部分5.8s和ITS－2)基因序列測定結(jié)果 39株紅色毛癬菌及次年復(fù)發(fā)菌株片段大小均約為320 bp,與基因庫紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC28188基因序列同源性比較,用Blast軟件分析,同源性均達(dá)99%,證明復(fù)發(fā)后的菌仍為紅色毛癬菌。

2.2 NTS區(qū)TRS－1和TRS－2 PCR指紋圖譜擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 TRS－1區(qū)PCR指紋圖譜擴(kuò)增結(jié)果 39例復(fù)發(fā)足癬患者中有36例紅色毛癬菌菌株NTS區(qū)中TRS－1區(qū)與原菌株P(guān)CR產(chǎn)物的指紋圖一致,可分為4型,其中18株為1型(菌株23’為代表)；8株為2型(菌株14’為代表)；5株為3型(菌株11’為代表)；5株為4型(菌株34’為代表)。見圖1～3。

圖1 2～13泳道為紅色毛癬菌TRS－1區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖。1、14泳道為Marker DL2000

2.2.2 TRS－2區(qū)PCR指紋圖譜擴(kuò)增結(jié)果 39例復(fù)發(fā)足癬患者紅色毛癬菌菌株與原菌株NTS區(qū)中TRS－2區(qū)PCR產(chǎn)物的指紋圖一致,而且每株菌的分子量大小也大致相同,列舉任意12株菌(圖4)。

2.3 菌株核糖體非轉(zhuǎn)錄區(qū)(NTS)內(nèi)TRS－1區(qū)和TRS－2區(qū)基因序列測定結(jié)果 TRS－1區(qū)以200 bp為一個(gè)拷貝單位串聯(lián)重復(fù)排列,緊接一個(gè)23～33 bp的部分重復(fù),并且每個(gè)拷貝單位的基因序列基本一致；TRS－2區(qū)是以77 bp為一個(gè)拷貝單位串聯(lián)重復(fù)排列,緊接一個(gè)27 bp的部分重復(fù),每個(gè)拷貝單位的序列也基本一致。

圖2 2～13泳道為12株紅色毛癬菌NTS區(qū)中TRS－1區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖。1、14泳道為Marker DL2000

圖3 2～13泳道為12株紅色毛癬菌NTS區(qū)中TRS－1區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖。1、14泳道為Marker DL2000

圖4 2～13泳道為任意12株紅色毛癬菌NTS區(qū)中TRS－2區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖。1、14泳道為Marker DL2000

2.3.1 每株菌TRS－1區(qū)重復(fù)單位基因序列基本相同,但38’菌和10’菌TRS－1區(qū)第一個(gè)重復(fù)單位的第198～200位堿基檢測到突變(TCG→CAT)(圖5、6), 28’菌TRS－1區(qū)第二個(gè)重復(fù)單位中第194位堿基檢測到突變(G→C)(圖7)。每株菌復(fù)發(fā)后TRS－2區(qū)重復(fù)單位基因序列大部分相同,其中17’菌的第二個(gè)重復(fù)單位第74位堿基檢測到突變(G→A)(圖8)。

2.3.2 TRS－1區(qū)和TRS－2區(qū)拷貝數(shù)變異 4’原菌株TRS－1區(qū)約為400 bp,此區(qū)內(nèi)包含1個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)27 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為360 bp,此區(qū)內(nèi)包含2個(gè)拷貝單位,緊接一個(gè)27 bp的部分重復(fù)。復(fù)發(fā)后菌株TRS－1區(qū)約為835 bp,此區(qū)內(nèi)包含3個(gè)拷貝單位,緊接一個(gè)25 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為480 bp,此區(qū)內(nèi)包含2個(gè)拷貝單位,緊接一個(gè)27 bp的部分重復(fù)。

圖5 38’菌TRS－1區(qū)第一個(gè)重復(fù)單位部分測序圖(箭頭示第198～200位堿基TCG→CAT)圖6 10’菌TRS－1區(qū)第一個(gè)重復(fù)單位部分測序圖(箭頭示第198～200位堿基TCG→CAT,因該反應(yīng)為第二個(gè)反應(yīng),測序時(shí)反向互補(bǔ),圖中ATG的反向互補(bǔ)序列即為CAT)圖7 28’菌TRS－1區(qū)第二個(gè)重復(fù)單位部分測序圖(箭頭示第194位堿基G→A)圖8 17’菌TRS－2區(qū)第二個(gè)重復(fù)單位部分測序圖(箭頭示第74位堿基G→A)

55’原菌株TRS－1區(qū)約為957 bp,此區(qū)內(nèi)包含3個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)23 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為360 bp,此區(qū)內(nèi)包含2個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)27 bp的部分重復(fù)。復(fù)發(fā)后菌株TRS－1區(qū)約為1310 bp,此區(qū)內(nèi)包含4個(gè)拷貝單位,第2個(gè)重復(fù)單位后面緊跟一個(gè)33 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為500 bp,此區(qū)內(nèi)包含2個(gè)拷貝單位,緊接一個(gè)27 bp的部分重復(fù)。

30’原菌株TRS－1區(qū)約為950 bp,此區(qū)內(nèi)包含3個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)23 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為480 bp,包含2個(gè)拷貝單位,緊接一個(gè)27 bp的部分重復(fù),并將其復(fù)發(fā)后菌株與其原菌株比較發(fā)現(xiàn), TRS－1區(qū)約為410 bp,此區(qū)內(nèi)包含1個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)27 bp的部分重復(fù),TRS－2區(qū)約為380 bp,此區(qū)內(nèi)包含2個(gè)拷貝單位,緊跟一個(gè)27 bp的部分重復(fù)。

3 討論

足癬是皮膚科常見的感染性疾病內(nèi)服和外用抗真菌藥可獲得暫時(shí)痊愈,但容易復(fù)發(fā),因此確定患者的復(fù)發(fā)是原有真菌復(fù)燃還是新的真菌再感染,對流行病學(xué)研究和完善臨床治療方案至關(guān)重要。臨床約72%的足癬由紅色毛癬菌感染所致,由于紅色毛癬菌嚴(yán)格的無性生殖特點(diǎn),其基因結(jié)構(gòu)是相當(dāng)保守的,種內(nèi)變異的程度也是有限的。紅色毛癬菌的核糖體DNA(rDNA)重復(fù)區(qū)存在多態(tài)現(xiàn)象,rDNA非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)有兩個(gè)串聯(lián)排列的亞重復(fù)元件(TRSs),即TRS－1區(qū)和TRS－2區(qū)。3通過對TRS1區(qū)重復(fù)單元的序列分析證實(shí)NTS區(qū)域長度變異主要是由于TRS－1區(qū)拷貝數(shù)的變異。4這種重復(fù)DNA片斷的多態(tài)性是局部的,與基因組存在的重組和突變所致的多樣性無關(guān),針對整個(gè)基因組多樣性的PCR不能發(fā)現(xiàn)這種小衛(wèi)星或微衛(wèi)星多態(tài)性,近年來常針對rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行種間分類。5紅色毛癬菌rDNA的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)亞單位TRS－1和TRS－2 (TRSs),在不同的菌株拷貝數(shù)不同,為株間變異區(qū)所在,故TRSs區(qū)指紋圖譜能顯示株間差異。6本研究將39例足癬的紅色毛癬菌及其復(fù)發(fā)后的紅色毛癬菌核糖體非保守區(qū)NTS內(nèi)的兩個(gè)重復(fù)亞單位(TRS－1, TRS－2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)內(nèi)TRS－1、TRS－2區(qū)的基因序列基本穩(wěn)定,但38’菌和10’菌在TRS－1區(qū)第一個(gè)重復(fù)單位有三個(gè)堿基發(fā)生置換, 28’菌在TRS－1區(qū)第二個(gè)重復(fù)單位有一個(gè)堿基發(fā)生置換說明核糖體非保守區(qū)(NTS)中TRS－1區(qū)的序列還是相當(dāng)穩(wěn)定的,說明姐妹染色體不等位交換并非經(jīng)常發(fā)生,從而證實(shí)了紅色毛癬菌在一年中的保存過程中,菌種的NTS區(qū)中重復(fù)單位的數(shù)目和長度穩(wěn)定,但重復(fù)單位中個(gè)別堿基有可能發(fā)生重組或改變。3

足癬復(fù)發(fā)的原因諸多,隨著抗真菌藥物在臨床應(yīng)用日益廣泛,真菌耐藥已成為日益嚴(yán)重的問題。536例足癬患者復(fù)發(fā)的原因可能為治療不徹底,導(dǎo)致皮膚上有殘存菌,次年夏季氣溫升高,殘存菌迅速繁殖,再次出現(xiàn)臨床癥狀。3例患者基因保守序列鑒定為紅色毛癬菌,但TRS－1區(qū)基因序列與原菌株不同,可能因徹底治療后,在某些易感因素下再次感染了不同型別的紅色毛癬菌,但僅占總例數(shù)的8.33%。因本研究樣本數(shù)尚少,暫未發(fā)現(xiàn)有其它種屬的淺部真菌感染。

1CURTIS JW.The two foot－one hand disease.Bull Assoc milit Dermatol,1964,13:1.

2李筱芳,陳輝,崔凡,等.淺部真菌病臨床標(biāo)本致病菌提取方法的初步研究.醫(yī)學(xué)研究雜志,2006,3:18－20.

3 Jackson CJ,Barton RC,Evans EG.Species identification and strain differentiation of dematophyte fungi by analysis of ribosomal DNA intergenic spacer regions.JClin Microbiol,1999,37 (4):931－936.

4 Jackson CJ,Barton RC,Kelly SL,et al.Strain identification of Trichophyton rubum by specific amplification of subrepeat elements in the ribosomal DNA nontranscribed spacer.JClin Microbiol,2000,38(12):4527－4534.

5 Loeffler J,Stevens DA.Antifungal drug resistance.Clin Infect Dis,2003,36(Supp l 1):3－41.

6 Jousson O,Léchenne B,Bontems O,et al.Secreted subtilisin gene fam ily inTrichophyton rubrum.Gene,2004,339:79－88.

(收稿:2013－07－18 修回:2013－12－09)

The changes of DNA sequence of pathogen after relapse in athlete's foot

DU Ying-chun,ZHENG Jia-di.Department ofDermatology,Xiamen Hospital of T.C.M,361000

Objective:To determine the changes of DNA sequence of Trichophytin rubrum after relapse in athlete's foot.Methods:Two epetition subunits(TRS－1,TRS－2)of Trichophyton rubrum ribosomal non－conservertive region NTSwere amplified by PCR and followed by gene sequencing in 39 patients with relapsed athlete's foot.Results:The Trichophyton rubrum ribosomal non－conservative region NTS in the first and the second isolates of tinea pedis was very close(the isogeny was 99%).Individual base mutation happened in TRS－1 region of 3 cases or TRS－2 region of1 case.Copy number of gene duplication sequence in TRS－1 region of ribosomal non－conservative region was seen in 3 cases.Conclusion:The genotype of Trichophyton rubrum is stable in the isolates of the patients with relapsed tinea pedis.Recurrence of tinea pedis wasmost likely caused by the existing fungi rather than new infectionswith other stains of fungi.

tinea pedis；Trichophyton rubrum；ribosomal non－conservative region；gene sequencing

福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題(編號(hào):XB2012039)

1廈門市中醫(yī)院皮膚科,福建廈門,361000

2廈門市中醫(yī)院神經(jīng)外科,福建廈門,361000