徐麗麗郁 博姚如永陳宏泉?趙秀峰倪少萍

·論著·

芍藥苷對黑素細(xì)胞生物活性的影響

徐麗麗1郁 博1姚如永2陳宏泉1?趙秀峰1倪少萍1

目的: 檢測芍藥苷對體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素合成的影響。方法: 建立正常人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)體系,加入不同濃度(5～640μg/mL)芍藥苷并作用一定時(shí)間后,采用MTT法、體外氧化DOPA反應(yīng)法、NaOH法等分別測定黑素細(xì)胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素含量的變化。結(jié)果: 40～160μg/mL芍藥苷呈劑量依賴性抑制黑素細(xì)胞增殖,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；5～20μg/mL芍藥苷對酪氨酸酶活性呈劑量依賴性促進(jìn)作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；10～20μg/mL芍藥苷對黑素細(xì)胞黑素合成起促進(jìn)作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: 芍藥苷在較高濃度范圍內(nèi)(40～160μg/mL)對體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞增殖有劑量依賴性抑制作用；在較低濃度范圍內(nèi)(10～20μg/mL)對其黑素合成有促進(jìn)作用。

芍藥苷； 黑素細(xì)胞； 酪氨酸酶

芍藥苷(Paeoniflorin,PF)主要從毛茛科植物的根部提取,為黃酮類化合物,是白芍和赤芍的主要活性成分之一,以赤芍中含量為高,具有保肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、擴(kuò)血管、抗血栓形成、抗氧化等作用。芍藥苷因作用廣泛、毒性較低而具有較好的藥用前景。1黃褐斑及白癜風(fēng)均為臨床常見的色素障礙性皮膚病,前者為面部的黃褐色色素沉著斑,后者則為色素脫失斑。目前芍藥復(fù)方制劑在治療黃褐斑中的有效性已有報(bào)道；2,3很多治療白癜風(fēng)的中藥方劑中也含有芍藥成分,4但在黃褐斑及白癜風(fēng)治療中芍藥的劑量及配伍不同。5,6皮膚顏色的深淺是由黑素細(xì)胞合成黑素?cái)?shù)量的多少決定,黑素細(xì)胞位于表皮基底層,當(dāng)皮膚受到紫外線照射或體內(nèi)激素發(fā)生變化時(shí),局部皮膚黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素量增加。7黑素合成過程中,酪氨酸經(jīng)酪氨酸酶催化羥化為多巴并進(jìn)而形成多巴醌,經(jīng)DHI氧化酶和DHICA氧化酶的作用,生成真黑素,其中酪氨酸酶是黑素生成的起始限速酶。8

本實(shí)驗(yàn)選取芍藥苷作為實(shí)驗(yàn)藥物,采用人表皮正常黑素細(xì)胞作為受試細(xì)胞,就芍藥苷對其生物活性的影響進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究,以探討芍藥苷治療兩類障礙性皮膚病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 皮膚標(biāo)本 取包皮切除術(shù)切除的人正常包皮,供皮者年齡為15～25歲(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院低溫醫(yī)學(xué)科提供)。

1.1.2 主要試劑 芍藥苷(由寧波立華制藥惠贈,純度為95%,用完全培養(yǎng)基配制為1000 mg/L原液,過濾除菌后,入4℃冰箱避光貯藏,備用。臨用時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度),Dispase II酶(批號12594400)、胰蛋白酶、PBS、胎牛血清、F－12培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、TritonX－100均購自青島福林生物化學(xué)有限公司,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Sigma,美國)、左旋多巴(L－DOPA,Sigma,美國)、NaOH粉末由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heraeys公司),離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司),細(xì)胞培養(yǎng)板(青島福林生物化學(xué)有限公司),倒置顯微鏡(OLYMPUS)、自動酶標(biāo)儀(BIO－RAD)、水平震蕩儀(Heidolph)等。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞原代培養(yǎng) 取包皮環(huán)切術(shù)標(biāo)本,用1 ×PBS反復(fù)沖洗,PBS＋雙抗(1%青霉素/鏈霉素雙抗)浸泡15min,眼科剪去凈皮下組織。標(biāo)本用Dispase II酶4℃消化24 h,分離真表皮。獲取的表皮1×PBS漂洗后剪成小塊,胰酶消化吹打成單細(xì)胞懸液,離心后接種于F12培養(yǎng)基,置5%CO237℃孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后換液,以后每2 d換液1次,14～21 d細(xì)胞傳代。

1.2.2 MTT法測定芍藥苷對黑素細(xì)胞生長抑制率的測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞,常規(guī)消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL,取200μL接種于96孔板,置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。共設(shè)立6個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每孔加200μL用培養(yǎng)基稀釋好的藥物,使各實(shí)驗(yàn)組藥物終濃度分別為10、20、40、80、160、320μg/m L,每個(gè)濃度設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立陰性對照組(培養(yǎng)基＋細(xì)胞組)和空白對照組(單純培養(yǎng)基組)。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用24 h后,每孔加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液,4 h后小心吸棄上清,每孔加入100μLDMSO溶液,置于水平震蕩儀震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀空白孔調(diào)零,測定各孔490 nm處的A值。各實(shí)驗(yàn)組的黑素細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為:細(xì)胞生長抑制率＝(1－各濃度平均A值)/對照組平均A值×100%

1.2.3 測定芍藥苷對黑素細(xì)胞黑素合成量的影響采用NaOH裂解法,9細(xì)胞接種方法及分組同上。芍藥苷作用24 h后,吸棄上清,用1×PBS溶液清洗2遍,每孔加入100μL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,置37℃水浴鍋?zhàn)饔? h。酶標(biāo)儀空白孔調(diào)零后測定460 nm波長處的A值。各實(shí)驗(yàn)組相對黑素含量＝(實(shí)驗(yàn)組A值－空白對照組A值)/(陰性對照組A值－空白對照組A值)×100%。

1.2.4 測定芍藥苷對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響采用體外氧化DOPA反應(yīng)法,10細(xì)胞接種方法和分組同上。藥物作用24 h后,小心吸去上清液,用1× PBS液清洗2遍,每孔加入10 m L/L的Triton X－100溶液90μL,震蕩5 min溶解細(xì)胞,經(jīng)37℃預(yù)溫后每孔加人l%的L－多巴10μL,37℃孵育30 min。于490 nm波長處空白孔調(diào)零后,測各孔A值。酪氨酸酶相對活性＝(含藥組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對黑素細(xì)胞生長的影響 芍藥苷作用24 h后,40～640μg/mL黑素細(xì)胞生長呈抑制狀態(tài),與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且40～160μg/ mL濃度組組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),160～640μg/mL實(shí)驗(yàn)組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1、圖1。

2.2 芍藥苷對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 根據(jù)MTT結(jié)果選取5～160μg/m L濃度組,藥物作用細(xì)胞24 h后,各組酪氨酸酶活性均提高,與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中,5～20μg/mL濃度組酪氨酸酶活性提高呈劑量依賴性。20～160μg/ m L組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1、圖2。

圖1 不同濃度芍藥苷對黑素細(xì)胞活力抑制率(%)

圖2 不同濃度芍藥苷對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響(%)

2.3 芍藥苷對黑素細(xì)胞黑素合成量的影響 實(shí)驗(yàn)濃度如上,藥物作用細(xì)胞24 h后,10～160μg/mL濃度組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),各實(shí)驗(yàn)組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、圖3。

圖3 不同濃度芍藥苷對黑素細(xì)胞黑素含量的影響(%)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí),芍藥苷在40～640μg/mL濃度組對體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞增殖抑制率與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在40～160μg/m L濃度組抑制率呈劑量依賴性提高,提示芍藥苷在高濃度40～160μg/mL時(shí)劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞增殖。李劍等11研究發(fā)現(xiàn)中藥單體芍藥苷10～160μg/ mL可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其不符,可能與藥物產(chǎn)地、純度等不同有關(guān)。

劉之力等12觀察了56種中藥對酪氨酸酶的影響,發(fā)現(xiàn)27種對酪氨酸酶活性具有激活作用,并在活體棕色豚鼠上外用對酪氨酸酶具有激活作用的中藥,結(jié)果顯示部分中藥可使豚鼠皮膚黑素顆粒增加。雷鐵池等13觀察了86種中藥對酪氨酸酶的影響,發(fā)現(xiàn)19種對酪氨酸酶活性具有激活作用,其中包括赤芍。許愛娥等14選取白癜風(fēng)治療中使用頻率較高的48種中藥,測定其對酪氨酸酶的作用,結(jié)果顯示13種對酪氨酸酶有激活作用,其中包括白芍,與劉之力等12的研究結(jié)果部分不同。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí),芍藥苷在5～160μg/mL濃度時(shí),對體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性具有促進(jìn)作用,各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在5～20μg/m L濃度時(shí)呈劑量依賴性。40～160μg/m L濃度組組間無差異(P＞0.05)。在相同條件下,對黑素合成具有促進(jìn)作用,其中10～160μg/m L實(shí)驗(yàn)組與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組組間無差異(P＞0.05)。說明芍藥苷在較低濃度時(shí)10～20 μg/mL即有與高濃度相近的對黑素細(xì)胞黑素合成的促進(jìn)作用,李劍等11證實(shí)中藥單體芍藥苷在20μg/mL濃度時(shí)增強(qiáng)酪氨酸酶活性及促進(jìn)黑素合成,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

本實(shí)驗(yàn)酪氨酸酶活性提高及黑素合成量增多并未呈平行增高趨勢,說明芍藥苷在促進(jìn)酪氨酸酶活性機(jī)制之外,還可能通過其他途徑影響黑素的產(chǎn)生。隨著芍藥苷藥物濃度的升高,其抑制細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)、細(xì)胞活力下降從而導(dǎo)致黑素合成量下降,同時(shí)亦可能作用于黑素合成的其他環(huán)節(jié),如抑制其他酶的活性、影響黑素轉(zhuǎn)運(yùn)和黑素降解等途徑。8,12

本實(shí)驗(yàn)中,芍藥苷在高濃度(40～160μg/mL)時(shí)劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞增殖,因此推測高濃度芍藥苷可應(yīng)用于黃褐斑等色素沉著性皮膚病的治療。芍藥苷在低濃度(10～20μg/mL)時(shí)相對黑素含量與高濃度組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),提示芍藥苷在較低濃度時(shí)就達(dá)到與較高濃度相似的促進(jìn)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞黑素合成的作用,可為其治療白癜風(fēng)提供一定的理論參考價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過研究不同濃度芍藥苷作用后黑素細(xì)胞活力及酪氨酸酶活性、黑素含量的變化,探討了芍藥苷治療黃褐斑及白癜風(fēng)兩類色素障礙性皮膚病的可能機(jī)制,為不同濃度的芍藥苷制劑治療色素障礙性皮膚病提供了實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ),有利于該藥物的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

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14許愛娥,王遂泉,周渭珩.常用中藥對酪氨酸酶的激活作用.中華皮膚科雜志,1998,31(1):48.

(收稿:2013－11－28 修回:2013－12－25)

Effect of paeoniflorin on biological activity in normal human malanocytes in vitro

XU Li-li,YU Bo,YAORu-yong,et al.Department ofDermatology,the Affiliated Hospital ofQingdao University,Qingdao,266003

Objective:To investigate the effect of paeoniflorin on cell proliferation,tyrosinase activity and melanin synthesis in cultured normal human melanocutes.Methods:After paeoniforin(5～640μg/mL)was added into cultured normal humanmalanocytes,the effect of paeoniflorin on the proferation ofmelanocytes,tyrosinase activity and synthesis ofmelanin inmelanocytes weremeasured by MTTmethod,dopamine oxidation method and NaOH method,respectively.Results:40～160μg/mL paeoniflorin inhibited the growth ofmelanocytes in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of5～20μg/mL paeoniforin were added,the tyrosinase activity was significantly increased in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of10～20μg/mL paeoniforin were added,themelanin synthesiswere significantly increased(P＜0.05).The differences in the resultsmentioned above among the testgroups and control group were significant(all P s＜0.05).Conclusion:Paeoniflorin in concentrations of 40～160μg/mL can inhibit the proliferation in cultured normal human malanocytes in a concentration－dependentmanner.When the concentration of 10～20μg/mL is used themelanin synthesis is promoted.

paeoniflorin；melanocyte；tyrosinase

山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(編號:2011－199)

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(編號:2011YD18012)

青島大學(xué)附屬醫(yī)院,青島,266003

?通信作者