韓 瀟，周道斌，段明輝，汪 玄，趙永強，沈 悌，武永吉

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科，北京100730)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodkin lymphoma，NHL)常并發(fā)貧血，總體發(fā)生率約30%［1］，貧血原因復雜，其中慢性病貧血(anemia of chronic disease，ACD)最常見，突出特點為鐵利用障礙［2］。Hepcidin 是調(diào)節(jié)鐵代謝的核心激素，其不恰當升高可導致鐵利用障礙［2］。以往認為hepcidin 主要由肝臟分泌，但最近研究顯示單核/巨噬細胞受到刺激后hepcidin 明顯升高［3-4］，對鐵代謝發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可能參與ACD的發(fā)病［5］。多發(fā)性骨髓瘤(multiple myloma，MM)患者血清和尿中hepcidin 濃度均升高，可能導致MM相關ACD 的發(fā)生［6-7］，而對于NHL 則缺乏此類報道。

本研究探討NHL 患者外周血單核細胞表達的hepcidin 在腫瘤相關ACD 中可能發(fā)揮的作用以及其升高的機制。

1 實驗方法

1.1 患者

患者簽署知情同意書聲明同意采取血標本用于科學研究，征得中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院倫理委員會的同意。

本實驗組中NHL 患者共61 人。中位年齡56歲(18 ～80 歲)，初治者36 例，復治者25 例，Ⅲ/Ⅳ期患者占68.9%(42/61 例)。NHL 組患者貧血的總體發(fā)生率為57.4%(35/61 例)，初治者38.9%(14/36 例)，復治者72%(18/25 例)。總體血紅蛋白濃度(113 ±21.7)g/L，貧血患者血紅蛋白濃度(97.0 ±14.6)g/L(表1，2)。

入選標準:根據(jù)WHO 2008 非霍奇金淋巴瘤診斷標準，均在北京協(xié)和醫(yī)院確診。年齡≥18 歲，包括初治和復治患者。初治患者:明確診斷后尚未接受化療。復治患者:確診后已經(jīng)接受至少2 程化療。貧血定義:血紅蛋白男性＜120 g/L，女性＜110 g/L。除外標準:近1 周內(nèi)無活動性感染的證據(jù)，腎臟受累，腎功能不全(Cr ＞132 μmol/L)，骨髓受累，胃腸道受累，胃腸道失血，溶血，脾功能亢進，淋巴瘤白血病，化療后的骨髓抑制期(WBC＜2 ×109/L)，缺鐵(血清鐵蛋白＜12 ng/mL)，血清葉酸＜3 ng/mL 或維生素B12＜100 pg/mL。

表1 NHL 組與正常對照組特征比較Table 1 NHL patients baseline characteristics

表2 NHL 患者疾病相關特征Table 2 NHL patients and disease characteristics

正常對照組:共21 人，為健康志愿者。條件符合以下標準:1)年齡≥18 歲;2)無潛在感染，血清C反應蛋白正常;3)無特殊藥物治療史;4)，血白細胞、血小板、血紅蛋白、血清鐵、總鐵結合力、血清鐵蛋白、轉鐵蛋白飽和度、血清葉酸、維生素B12、肝腎功能正常。

以上所有患者及健康志愿者均未接受補鐵、重組人促紅細胞生成素、和/或輸血治療。

收集患者及健康志愿者基礎實驗室指標(如血白細胞數(shù)，血紅蛋白，丙氨酸氨基轉移酶，血清鐵指標)，均為早晨空腹測得，采用臨床常規(guī)檢驗自動化方法檢測。

1.2 血標本的采集和單核細胞分離

早晨空腹狀態(tài)下采取患者或健康志愿者的外周靜脈血。血標本處理在采血后6 h 內(nèi)進行。無抗凝劑的血標本3 000 ×g 離心5 min，血清－70 ℃保存，用于測定IL-6 和TNF-α，EDTA 抗凝血使用1∶1 0.9%氯化鈉注射液稀釋后采用Ficoll-Hyaque(Sigma Chemical Co．，St.Louis，MO)密度梯度離心的方法分離外周血單個核細胞(peripheral-blood mononuclear cells，PBMCs)。CD14 + Dynabeads 磁珠(Dynal，Oslo，Norway)從PBMCs 中分選單核細胞。磁珠與CD14 +單核細胞的混合物在磁架(MPC-6，Dynal)上分離得到，用含有0.1%胎牛血清蛋白的PBS 清洗細胞，并用磁架分離。Dynalbeads 系統(tǒng)分離所得的細胞純度(＞95%)，免疫表型穩(wěn)定。將結合在磁珠上的細胞直接加入TRIzol 裂解，用于進行基因表達分析。

1.3 Real-time PCR 實時定量法測定單核細胞mRNA 表達

采用Trizol Reagent(invitrogen，carlsbad，CA)按照操作說明從外周血單核細胞中提取總RNA，總RNA 按照invitrogen superscriptTMⅢfirst-strand synthesis system 進行反轉錄，得到cDNA。按照Takara Perfect Real time 試劑盒(Takara Biotechnology 公司)操作說明利用ABI PRISM 7900 Sequence Detector system (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)進行實時定量PCR。β-actin 基因用作內(nèi)對照。相對基因表達量(靶基因的表達量，相對于內(nèi)對照)采用比較Ct 法的公式2－ΔΔCT計算。特異性引物序列其引物序列及擴增片段見表3。

1.4 ELISA 法測定血清IL-6，TNF-α 濃度

患者血清IL-6 和TNF-α 濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒R＆D(Quantikine HS ELISA Kit;Minneapolis，MN)。IL-6 靈敏度為0.04 pg/mL，TNF-α 的靈敏度為0.1 pg/mL。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 16．0 for windows 軟件包，計量資料以均值±標準差(±s)表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本t 檢驗，雙尾(方差齊者用t檢驗，方差不齊者用校正t 檢驗)，非正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney U 檢驗);雙變量關系采用直線相關性分析，方差分析檢驗。

2 結果

2.1 患者與正常對照組單核細胞hepcidin 以及血清IL-6、TNF-α，單核細胞IL-6、TNF-α 的比較

NHL 組單核細胞hepcidin mRNA 表達高于正常對照組，單核細胞IL-6 mRNA 表達也升高;單核細胞TNF-α mRNA 表達與血清TNF-α 濃度均高于正常(圖1)。

2.2 患者單核細胞hepcidin 與血紅蛋白濃度的相關性

NHL 組單核細胞hepcidin mRNA 的表達與血紅蛋白濃度似呈負相關的趨勢，但無統(tǒng)計學相關性(圖2)。

表3 引物序列及擴增片段Table 3 Primer sequences and amplified fragments

圖1 NHL 患者、正常人、IDA 患者單核細胞hepcidin、IL-6、TNF-α mRNA 表達以及血清IL-6、TNF-α 濃度Fig 1 Monocytes hepcidin，IL-6，TNF-α mRNA expression and serum IL-6，TNF-α in NHL patients and normal controls(±s)

圖2 NHL 患者單核細胞hepcidin 與血紅蛋白濃度(Hb)的相關性Fig 2 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and hemoglobin in NHL patients

2.3 初治患者與復治患者單核細胞hepcidin 與血紅蛋白濃度的相關性

NHL 初治患者單核細胞hepcidin mRNA 的表達與血紅蛋白濃度呈負相關(圖3)。

2.4 初治患者貧血者與無貧血者單核細胞hepcidin 的比較

NHL 初治患者共36 例，其中貧血者14 例，無貧血者22 例。NHL 初治患者貧血者血紅蛋白濃度為97.0 ±14.6 g/L，無貧血者血紅蛋白濃度為130 ±13.1 g/L，初治NHL 貧血者單核細胞hepcidin mRNA 的表達高于無貧血者，同時也高于正常對照(圖4)。

圖3 NHL 初治患者與復治患者單核細胞hepcidin與血紅蛋白濃度(Hb)的相關性Fig 3 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and hemoglobin in untreated and treated NHL patients

2.5 初治患者單核細胞hepcidin 與鐵代謝相關指標，血清IL-6、TNF-α 及單核細胞IL-6、TNF-α 的相關性

NHL 初治患者單核細胞hepcidin mRNA 的表達與與血清IL-6 濃度、單核細胞IL-6 mRNA 的表達呈正相關(圖5)。

圖4 初治NHL 貧血者、無貧血者及正常對照單核細胞hepcidin 的比較Fig 4 Monocytes hepcidin in untreated NHL patients with anemia and without animia and normal controls

2.6 初治患者單核細胞IL-6、TNF-α 與血清IL-6、TNF-α 的相關性

NHL 初治患者單核細胞IL-6 mRNA 的表達與血清IL-6 濃度呈正相關，單核細胞TNF-α mRNA 的表達與血清TNF-α 濃度呈正相關(圖6)。

2.7 初治患者單核細胞hepcidin 與CRP 及LDH的相關性

初治NHL 患者單核細胞hepcidin mRNA 的表達與血清CRP 及LDH 均呈正相關(圖7)。

3 討論

ACD 尚無統(tǒng)一的診斷標準，主要依靠鐵代謝指標及除外其他疾病診斷［2］。本研究NHL 患者中發(fā)生貧血者，主要為輕到中度正細胞正色素性貧血，鐵蛋白升高，SI 和TIBC 下降，同時入組時已除外如骨髓受累，脾亢等其他原因導致的貧血，大致符合ACD 的診斷。

hepcidin 主要由肝臟合成和分泌［8］，但最近發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細胞在炎性反應刺激下也可高表達hepcidin［4-5］。慢性感染或自身免疫病相關的ACD患者外周血單核細胞hepcidin mRNA 的表達升高，可能參與鐵代謝調(diào)節(jié)［9］。NHL 患者外周血單核細胞hepcidin 是否升高，是否與Hb 水平、鐵代謝相關蛋白、體內(nèi)炎性因子等有關，尚不清楚。

圖5 NHL 初治患者單核細胞hepcidin 與SF、TSAT%、血清及單核細胞IL-6、血清及單核細胞TNF-α 的相關性Fig 5 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and SF，TSAT%，serum/monocytes IL-6，serum/monocytes TNF-α in untreated NHL patients

圖6 NHL 初治患者單核細胞IL-6、TNF-α 與血清IL-6、TNF-α 的相關性Fig 6 Correlation between monocytes IL-6 mRNA and serum IL-6，monocytes TNF-α and serum TNF-α in untreated NHL patients

圖7 NHL 初治患者單核細胞hepcidin mRNA 與血清CRP、LDH 的相關性Fig 7 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and serum CRP/LDH in untreated NHL patients

本研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞hepcidin 在NHL患者中明顯升高，且在初治患者中與Hb 負相關，初治患者中貧血者高于無貧血者，可見NHL 初治患者Hb 水平可能受hepcidin 的影響。但復治患者外周血單核細胞hepcidin 與Hb 水平無關聯(lián)，研究顯示NHL 患者貧血累計發(fā)生率隨化療次數(shù)增加而升高［9］，此外一些細胞毒藥物可直接抑制紅系干/祖細胞，縮短紅細胞壽命［10］，由此推測復治患者發(fā)生貧血的主要因素是化療藥物而非hepcidin。

hepcidin 是調(diào)節(jié)鐵在不同鐵池中分布的核心激素，可引起鐵在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的儲留和低鐵血癥［11］，本組初治患者中發(fā)生貧血者單核細胞hepcidin mRNA 的表達高于無貧血者，同時鐵代謝指標提示鐵相對缺乏，提示NHL 相關ACD 的發(fā)病機制可能與體內(nèi)hepcidin 升高引起鐵利用障礙有關。

IL-6 是誘導hepcidin 升高的主要炎性細胞因子［12-13］，TNF-α 對hepcidin 的誘導作用微弱［14］。MM 初治患者尿hepcidin 與血清IL-6 濃度正相關而與TNF-α 無關［7］，本研究中NHL 初治患者單核細胞hepcidin 與血清IL-6 濃度正相關而與TNF-α 無關，由此看來，淋巴瘤患者體內(nèi)的hepcidin 可能也主要受IL-6 影響，而非TNF-α。此外，本研究還顯示單核細胞IL-6 與自身hepcidin 正相關，因此推測單核細胞分泌的IL-6 可能對自身hepcidin 有上調(diào)作用。

最后，本研究還顯示NHL 初治患者單核細胞hepcidin 與LDH 及CRP 明顯相關，由于血清及尿hepcidin 檢測未常規(guī)開展，LDH 和CRP 均為常規(guī)檢測指標，可能協(xié)助判斷體內(nèi)hepcidin 水平。

本實驗雖然顯示NHL 患者體內(nèi)單核細胞hepcidin 與貧血、鐵蛋白、IL-6 等相關，但未能證實其在ACD 中的具體機制，未測定單核細胞hepcidin 蛋白，此外正常對照選擇青年可能低估正常人群單核細胞hepcidin 水平［15］。

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