龍向淑，吳 強，宋 方，黃 晶，張林軍

(貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽550002)

RAS信號途徑參與干擾素-α抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖

龍向淑，吳 強*，宋 方，黃 晶，張林軍

(貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽550002)

目的探討RAS信號途徑在干擾素-α(IFN-α)抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖中的作用。方法應(yīng)用轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬時干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs，以非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組為對照組，用MTT法測定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，RT-PCR 法和Western blot分別檢測P204 mRNA、P204和Ras蛋白的表達及RAF與ERK的磷酸化水平。結(jié)果與對照組比較，IFN-α組P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)(Plt;0.01)，細(xì)胞活力和細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換下調(diào)(Plt;0.01)，伴RAS蛋白表達減少(Plt;0.01)，RAF及ERK磷酸化水平下降(Plt;0.01)；轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA后再加IFN-α干預(yù)，P204 mRNA及蛋白表達下調(diào)(Plt;0.01)，而G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(Plt;0.01)，且RAS蛋白表達和RAF及ERK磷酸化水平亦下調(diào)(Plt;0.01)。結(jié)論RAS信號途徑參與IFN-α抑制大鼠VSMCs增殖。

干擾素；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；干擾素誘導(dǎo)蛋白；P204；RAS信號途徑

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)遷移、增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使血管內(nèi)膜增生是血管成形術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化及高血壓等血管增殖性疾病發(fā)病的主要機制，有效抑制VSMCs增殖，對上述疾病的防治具有重要意義。干擾素-α(Interferon alpha, IFN-α)可誘導(dǎo)P204表達而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纖維細(xì)胞增殖[1- 3]。本研究進一步探討IFN-α抑制大鼠VSMCs增殖的可能機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑(盒)

清潔級SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，年齡約5周齡，體質(zhì)量120 ～140g[第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(渝)2012-0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclone公司)；α-SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)；四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Sigma 公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(C1052)和Tubulin抗體(碧云天公司)；Trizol 總RNA提取試劑(DP405)、2×Taq PCR MasterMix (KT201)和100 bp DNA Ladder(北京天根公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR擴增引物由大連寶生物工程有限公司合成(表1)；P204抗體(Santa Cruz公司)；RAS、p-RAF及p-ERK 44/42抗體(Abcam公司)。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

按文獻[4]的方法培養(yǎng)VSMCs。取4～6代細(xì)胞用于實驗。實驗分3組：非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組設(shè)為對照組(control)、IFN-α干預(yù)組(IFN)和IFI204 siRNA轉(zhuǎn)染+IFN-α干預(yù)組(siRNA+ IFN)。IFN組用終濃度為2×106U /L IFN-α干預(yù)6 h，siRNA+IFN組先瞬時轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA干預(yù)6 h，后與IFN組同步加IFN-α干預(yù)6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.3 RT-PCR檢測mRNA表達

按Trizol 總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，取1 μg 按RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取產(chǎn)物3 μL進行PCR循環(huán)，PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，UVP800型凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 Western blot檢測蛋白表達

按文獻[5]的方法檢測蛋白表達。

1.5 MTT實驗

收集對數(shù)增殖期細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)3×103個/孔接種于96孔板，按上述分組進行相應(yīng)干預(yù)。培養(yǎng)板用平板離心機4 000r/ min離心5 min，吸盡上清液。每孔加入150 μL DMSO，置旋轉(zhuǎn)搖床上低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

按試劑盒(C1052)說明書檢測細(xì)胞周期。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)因素對P204 mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較，IFN組P204 mRNA和蛋白表達增多，而siRNA+IFN組P204 mRNA和蛋白表達減少(Plt;0.01)；與IFN組比較，siRNA+IFN組P204 mRNA和蛋白表達減少(Plt;0.01)(圖1，表2)。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group圖1 干預(yù)因素對大鼠VSMCs P204 mRNA及蛋白表達的影響Fig 1 Effect of intervention factor on expression of P204 mRNA and protein in VSMCs in rats

2.2干預(yù)因素對RAS蛋白表達和RAF及ERK磷酸化水平的影響

與對照組比較，IFN組及siRNA+IFN組RAS蛋白表達減少，RAF及ERK磷酸化水平降低(Plt;0.01)；siRNA+IFN組與IFN組比較，上述指標(biāo)無明顯變化(圖2，表2)。

2.3 IFN-α對VSMCs增殖及細(xì)胞周期的影響

與對照組比較，IFN組及siRNA+IFN組的MTT吸光度A值降低(Plt;0.01)(表2)；IFN組和siRNA+IFN組的G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(Plt;0.01)(圖3，表2)。

3 討論

IFN具有抗病毒、抗增殖、影響細(xì)胞生長和分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等功能[6]。它與相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)一系列蛋白表達而發(fā)揮上述功能[7]。P204是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員，其編碼基因IFI204在鼠的心肌、骨骼肌、腎及成骨細(xì)胞等多種組織及細(xì)胞存在豐富表達[8- 9]。IFN的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)功效已明確，而其抗增殖、促凋亡或存活、促進衰老和分化及抑制血管生成的作用及機制尚存在爭議[6]。文獻報道[1- 3]，在大鼠的主動脈外膜成纖維細(xì)胞和VSMCs，IFN-α可促進P204表達而抑制細(xì)胞增殖。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group圖2 干預(yù)因素對大鼠VSMCs RAS蛋白表達和RAF及ERK磷酸化水平的影響Fig 2 Effect of intervention factor on expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK in VSMCs in rats

本結(jié)果顯示， IFN-α干預(yù)可降低VSMCs細(xì)胞活力，阻滯或延緩VSMCs細(xì)胞周期由G0/G1期進入S期，伴P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)，進一步證實IFN-α可通過促進P204表達而抑制大鼠VSMCs增殖。除P204途徑外，IFN-α是否尚存在其他影響VSMCs增殖的機制？ 生長因子介導(dǎo)的RAS信號傳導(dǎo)途徑是諸多信號途徑中與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的重要信號途徑之一。RAS、RAF為ERK活化的上游信號蛋白，RAS在細(xì)胞外信號刺激下，轉(zhuǎn)化為激活型RAS，后者逐級磷酸化活化RAF及MEK，最終激活ERK。活化的ERK入核并啟動相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄。本文表明，單純IFN-α干預(yù)可誘導(dǎo)P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)，伴RAS蛋白表達減少，其下游信號蛋白RAF及ERK磷酸化水平相應(yīng)下降，VSMCs增殖減少；轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA后再加IFN-α干預(yù)，P204 mRNA和蛋白表達減少，顯示了IFI204 siRNA對P204在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的抑制作用，而RAS蛋白表達及其下游信號蛋白RAF及ERK磷酸化水平亦下降，VSMCs活力降低，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，提示抑制VSMCs P204表達對IFN-α下調(diào)RAS蛋白表達、降低RAF和ERK磷酸化水平及抑制VSMCs增殖的作用無明顯影響，除P204途徑外，IFN-α抑制VSMCs增殖尚與其抑制RAS信號途徑的激活有關(guān)，IFN-α尚存在其他影響RAS信號途徑活化的機制。

表2 干預(yù)因素對相關(guān)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of intervention factor on related target(±s, n=3)

*Plt;0.01 compared with control;#Plt;0.05 compared with IFN group.

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group圖3 干預(yù)因素對大鼠VSMCs細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of intervention factor on cell cycle in VSMCs in rats

綜上所述，IFN-α可抑制大鼠VSMCs增殖，該效應(yīng)可能與IFN-α促進P204表達及抑制RAS信號途徑的激活有關(guān)，但其具體機制有待進一步明確。

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RAS signal pathway participates in interferon-α mediated inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

LONG Xiang-shu, WU Qiang*, SONG Fang, HUANG Jing, ZHANG Lin-jun

(Dept. of Cardiology, Guizhou Province People’s Hospital, Guiyang 550002,China)

ObjectiveTo study the action of RAS signaling pathway in interferon alpha (IFN-α) mediated to inhibition proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats.MethodsCultured VSMCs were treated with transfectionIFI204 siRNA and/or IFN-α. Nonspecific siRNA transfection group was as control group. The cell vitality was detected by MTT method, and the cell cycle was analyzed by flow cytometry. The expression of P204 mRNA was determined by semiquantitative RT-PCR. P204, RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK was analyzed by Western blot.ResultsCompared with control group, the expression of P204 mRNA and protein up-regulated(Plt;0.01), the cell vitality and the cell cycle of G1/S transition down-regulated(Plt;0.01). In the process of the above, the expression of RAS protein decreased(Plt;0.01) and the phosphorylation levels of RAF and ERK droped(Plt;0.01); When intervented with IFN-α after transfectionIFI204 siRNA, down-regulated the expression of P204 mRNA and protein were down-regulated(Plt;0.01), and cells of G0/G1stage increased and S stage decreased(Plt;0.01), but the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK did not increase correspondingly(Plt;0.01).ConclusionsRAS signal pathway participates in interferon-α mediated inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells in rats.

interferon; vascular smooth muscle cells; proliferation; interferon-inducible protein; P204; RAS signaling pathway

2013- 11- 25

2014- 01- 13

國家自然科學(xué)基金項目(81260030)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金 [黔省專合字(2009)30號]

*通信作者(correspondingauthor)： gzgywq@126.com

1001-6325(2014)07-0882-04

研究論文

R 363

A