吳勝昔，陳永文，朱廣倍，費 蕾，吳玉章*

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2.第三軍醫(yī)大學 基礎(chǔ)部 免疫學教研室，重慶 400017)

B7-H1啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及活性檢測

吳勝昔1，陳永文2，朱廣倍1，費 蕾2，吳玉章2*

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2.第三軍醫(yī)大學 基礎(chǔ)部 免疫學教研室，重慶 400017)

目的構(gòu)建含B7-H1啟動子的熒光素酶報告基因載體，轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞進行活性檢測。方法PCR擴增B7-H1啟動子上游區(qū)域基因片段，并插入到含有熒光素酶報告基因的載體PGL3-Basic中構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后，將重組子轉(zhuǎn)染HepG2細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶表達活性。結(jié)果成功地構(gòu)建了6種不同長度的PGL3-B7-H1-Luc熒光素酶表達質(zhì)粒，分別命名為P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬時轉(zhuǎn)染HepG2后經(jīng)報告基因檢測，P175、 P203、 P398、 P723和P960所含5段啟動子均具有轉(zhuǎn)錄活性，IFN-γ作用后啟動子活性明顯增強，而P88轉(zhuǎn)染組IFN-γ作用后，熒光素酶活性無顯著變化。結(jié)論成功構(gòu)建了B7-H1啟動子的熒光素酶報告基因載體。

B7-H1；啟動子；雙熒光素酶報告基因檢測；活性測定

共刺激分子是一類細胞膜表面分子，其可為T、B細胞的活化提供輔助信號，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、活化及分化。而缺乏共刺激信號的抗原刺激易引起T細胞的耐受、無反應(yīng)性和細胞調(diào)亡[1]。近年研究表明共刺激信號通路參與了腫瘤的免疫逃逸，而通過共刺激信號途徑來誘導T細胞的免疫效應(yīng)功能進而治療腫瘤是個非常有前景的研究[2]。最近，在共刺激分子與腫瘤相互關(guān)系的研究中，人們的注意力集中在了新型的B7家族共刺激分子尤其是B7-H1(B7 homolog 1)分子上。對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1廣泛表達于各種腫瘤細胞[3]，并通過B7-H1/PD- 1(programmed death-1)途徑誘導腫瘤的免疫逃逸，表明B7-H1引起的效應(yīng)性細胞凋亡是腫瘤細胞免疫逃逸的一種重要機制[4]。本研究擬構(gòu)建6段包含不同長度B7-H1啟動子片段的熒光素酶報告基因載體, 轉(zhuǎn)染HepG2細胞，加入IFN-γ作用后檢測6段B7-H1啟動子的活性，為后續(xù)深入探討B(tài)7-H1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Trypsin)(Sigma公司)；瓊脂糖和Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；Ex Taq、KpnⅠ和XhoⅠ酶(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒和DNA抽提試劑盒(Omega公司)；T4 Ligase和Dual-Luciferase ReporterAssay System kit(Promega公司)。

1.2 細胞系和質(zhì)粒

人肝癌細胞HepG2細胞(本實驗室保存)；PGL3 -Basic Vector、含熒光素酶基因載體(Promega公司)；PRL-TK Vector和海腎螢光素酶對照報告基因載體(Promega公司)；PGL3/B7-H1- 2405(由韓國Dr.In-Hak Choi饋贈)。

1.3 含B7-H1啟動子報告基因載體的構(gòu)建

1.3.1 引物的設(shè)計及合成：根據(jù)B7-H1基因的序列自行設(shè)計引物，由上海英駿公司合成, 在合成的引物序列中導入了KpnⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶酶切位點(斜體部分)，供后續(xù)酶切鑒定用。上游引物見表1，下游引物均為5′-ccctcgagACAGAAGCGCGGCTG GT- 3′。

表1 B7-H1 5′啟動子非編碼區(qū)基因片段PCR上游引物Table 1 Amplification forward primers of B7-H1 5′ untranslated region gene fragments by PCR

1.3.2 啟動子基因的克?。阂訮GL3/B7-H1- 2405為模板，用表1所示引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預變性2 min, 加Ex Taq 0.2μL;94 ℃變性50 s,67.5 ℃復性1 min, 72 ℃延伸1 min, 循環(huán)30 次, 最后72 ℃再延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，獲得6條PCR擴增產(chǎn)物，大小分別是88、175、203、398、723和960 bp，參照Omega公司的膠回收試劑盒操作說明，回收并純化PCR產(chǎn)物。

1.3.3 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：回收PCR產(chǎn)物，用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切B7-H1啟動子基因的PCR產(chǎn)物和PGL3 -Basic載體，回收PCR產(chǎn)物和載體大片段，用T4 連接酶16 ℃連接12 h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌。用Omega公司試劑盒提取菌液中質(zhì)粒。經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后送上海英駿公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為P88、P175、P203、P398、P723和P960。

1.4 含B7-H1啟動子報告基因載體的活性檢測

1.4.1 細胞培養(yǎng)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：按照5×104/孔將HepG2細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞增殖至70%～80%匯合后進行轉(zhuǎn)染。用無血清DMEM稀釋待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，PGL3 -Basic載體、P88、P175、P203、P398、P723和P960均按0.8 μg/孔的量，PRL-TK Vector按0.8 ng/孔的量，按50 μL/孔的體積稀釋質(zhì)粒，輕輕混勻，每個質(zhì)粒做3個復孔。參照LipofectaminTMReagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說明，在HepG2細胞中進行P88/PRL-TK、P175/PRL-TK、P203/PRL-TK、P398/PRL-TK、P723/PRL-TK或P960/PRL-TK共轉(zhuǎn)染，同時設(shè)立PGL3 -Basic/PRL-TK共轉(zhuǎn)染作為陰性對照組。細胞在37 ℃培養(yǎng)48 h后檢測熒光素酶活性。第1組無需更換培養(yǎng)液; 第2組培養(yǎng)12 h后, 棄去培養(yǎng)液, 加入含100 ng/mL人重組IFN-γ的培養(yǎng)液, 0.5 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h, 測定熒光素酶活性。

1.4.2 雙熒光素酶報告基因活性的檢測：轉(zhuǎn)染48 h后用雙熒光報告系統(tǒng)試劑盒測定熒光素酶活性。去除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，用1×PBS(pH 7.4) 清洗細胞；每孔加100 μL被動裂解緩沖液PLB，室溫振搖15 min；裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移置1.5 mL 離心管中，低溫高速離心30 s，取上清；加100 μL檢測緩沖液Ⅱ(LARⅡ)于待測離心管中；取20 μL 細胞裂解產(chǎn)物，進行目的報告基因熒火蟲熒光素酶(firefly luc)及內(nèi)對照海腎素熒光素酶(renilla luc)檢測，計算firefly luc/renilla luc的比值，并以空載體PGL3-basic、PRL-TK Vector共轉(zhuǎn)染細胞作對照。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad prism5軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 B7-H1啟動子基因片段的PCR結(jié)果

PCR擴增B7-H1 5′啟動子非編碼區(qū)基因片段產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示，其基因片段大小與預計相符, 分別是88、175、203、398、723和960 bp大小的清晰條帶，表明已獲得B7-H1 5′啟動子非編碼區(qū)基因片段(圖1)。

M.DNA marker(DL2000); 1.B7-H1 960 bp; 2.B7-H1 723 bp; 3.B7-H1 398 bp; 4.B7-H1 203 bp;5.B7-H1 175 bp; 6.B7-H1 88 bp圖1 PCR擴增B7-H1啟動子非編碼區(qū)基因片段Fig 1 Amplification of B7-H1 5′-untranslated region gene fragments by PCR

2.2 含B7-H1啟動子區(qū)基因質(zhì)粒酶切的鑒定

重組質(zhì)粒P88、P175、P203、P398、P723和P960經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后電泳，分別切出與對應(yīng)目的基因大小相符的條帶，另外還有一條約5 000 bp條帶，與空載體PGL3大小相符(圖2)。這表明已成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。

M.DNA marker(DL2000); 1.P960; 2.P723; 3.P398； 4.P203; 5.P175; 6.P88圖2 含B7-H1啟動子區(qū)基因質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig 2 Identification of eukaryotic expression plasmids by restriction endonuclease analysis

2.3含B7-H1啟動子基因片段質(zhì)粒測序鑒定的結(jié)果

重組體中插入片段以及部分載體序列經(jīng)測序分析, 結(jié)果顯示各連接位點以及閱讀框架正確, 序列與對應(yīng)已知序列相符。選取P960、P723和P398測序的部分截圖(圖3A,B,C)，下劃線序列均為上游引物，表明重組質(zhì)粒P88、P175、P203、P398、P723和P960構(gòu)建成功。

2.4雙熒光素酶檢測報告系統(tǒng)分析IFN-γ對B7-H1啟動子活性的影響

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析IFN-γ對B7-H1啟動子活性的影響，結(jié)果顯示，P175、P203、P398、P723和P960比P88有更高的啟動子活性(Plt;0.001)；加IFN-γ作用組轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h后，B7-H1啟動子上游960 bp至175 bp區(qū)域熒光素酶的活性明顯升高，然而轉(zhuǎn)染重組子P88后，熒光素酶的活性顯著下降，P960與P172、P203、P398和P723質(zhì)粒相比，其啟動子活性更為突出(Plt;0.01)(圖4)。

3 討論

B7-H1是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個新的B7家族成員，與T細胞上的配體(PD- 1) 結(jié)合后可調(diào)節(jié)T細胞的活化及分化，還可通過與未知受體分子結(jié)合誘導T細胞凋亡[5- 6]。對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1廣泛表達于各種腫瘤細胞，并通過B7-H1/PD- 1途徑誘導腫瘤的免疫逃避[7- 9]。

但B7-H1分子通過何種信號通路參與腫瘤的免疫逃逸尚未明確。本研究采用PCR擴增B7-H1啟動子上游區(qū)域88、175、203、398、723和960 bp基因片段，并插入到含有熒光素酶報告基因的載體PGL3-Basic中構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后分別命名為P88、P175、P203、P398、P723和P960。雙熒光素酶活性分析表明，6個片段均包含核心啟動子部分。而P175、P203、P398、P723和P960相比P88顯示更高的啟動子活性；加IFN-γ作用組轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h后，B7-H1啟動子上游960 bp至175 bp區(qū)域熒光素酶的活性明顯升高，然而轉(zhuǎn)染重組子P88后，熒光素酶的活性顯著下降。啟動子分析提示B7-H1 5′啟動子非編碼區(qū)有幾個NF-κB結(jié)合位點[10], NF-κB在亞溶解攻膜復合物C5b- 9誘導腎小管上皮細胞上B7-H1的表達及IFN-γ誘導皮膚纖維原細胞上的B7-H1表達中起重要作用[11- 12]。通過GenomeNet分析B7-H1啟動子上游175 bp內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)了一個NF-κB基序結(jié)合位點(位于-128 bp～-119 bp)，P88所含啟動子區(qū)段無NF-κB結(jié)合位點(圖5)，推測IFN-γ可能通過NF-κB通路上調(diào)肝癌HepG2細胞B7-H1的表達，但有待進一步驗證。P960與P172、P203、P398和P723質(zhì)粒相比，其啟動子活性更為突出，通過GenomeNet分析發(fā)現(xiàn)，位于B7-H1啟動子上游960 bp～723 bp之間可能存在deltaE、CdxA、P300和E2F等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，但P723所含啟動子區(qū)域無P300、E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(圖5)。推測IFN-γ還可能通過結(jié)合P300或E2F轉(zhuǎn)錄因子信號上調(diào)肝癌HepG2細胞B7-H1的表達，需進一步實驗來證實。

圖3 含B7-H1啟動子5′非編碼區(qū)基因質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果Fig 3 Sequences analysis of the B7-H1 gene 5′-UTR promoters

#Plt;0.001 compared with P88；*Plt;0.01 compared with P723圖4 雙熒光素酶報告基因分析IFN-γ對B7-H1啟動子活性的影響Fig 4 Dual-luciferase reporter gene assay was per- formed to detect the effect of IFN-γ on the activity of B7-H1 promoters

The 980 bp sequence of the 5′-flanking region of B7-H1 is shown; the translation start site is indicated by +1; the arrow indicates the transcription start site; underlined sequences are possible transcription factor binding sites, as predicted by GenomeNet

圖5B7-H1基因啟動子區(qū)域DNA序列
Fig5NucleotidesequenceofthepromoterregionofhumanB7-H1gene

總之，本研究成功構(gòu)建B7-H1啟動子的熒光素酶報告基因載體，并轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細胞后進行了熒光素酶活性分析，為后續(xù)深入探討B(tài)7-H1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制奠定實驗基礎(chǔ)。

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Construction of luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region and promoter activity assay

WU Sheng-xi1, CHEN Yong-wen2, ZHU Guang-bei1, FEI Lei2, WU Yu-zhang2*

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology，Chongqing 400054；2.Dept. of Immunology, the Third Military Medical University, Chongqing 400017, China)

ObjectiveTo construct luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region and to detect promoter activity in HepG2 cells.MethodsFragments of the B7-H1 gene 5′-UTR promoters were amplified by PCR and cloned into PGL3 basic vector and named as P88，P175, P203, P398, P723, and P960 respectively. Then HepG2 cells, were transfected with these constructed plasmids. The expression of luciferase before and after the addition of IFN-γ was detected by dual-luciferase(LUC) reporter assay system kit.ResultsFive luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region were successfully constructed. The recombinant constructs were transiently transfected into HepG2 cells. After the addition of IFN-γ, LUC detection assay showed that the expression of LUC was significantly enhanced by P175, P203, P398, P723 or P960，but not by P88.ConclusionsLuciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region were successfully constructed，which may be valuable for further study on B7-H1 promoter activity and molecular mechanism.

B7-H1；promoter；dual-luciferase reporter assay system；activity assay

2014- 02- 28

2014- 04- 17

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃(cstc2013jcyjA10068)；重慶市教委科學技術(shù)研究項目(KJ130802)

*通信作者(correspondingauthor)：wuyuzhang@yahoo.com

1001-6325(2014)07-0955-06

研究論文

R 392

A