何 政，吳 慧，萬榮華，鄭 軍

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 肝膽脾胰外科，湖北 宜昌 443002)

siRNA沉默CD55基因?qū)σ认侔〣xPC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

何 政，吳 慧，萬榮華，鄭 軍*

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 肝膽脾胰外科，湖北 宜昌 443002)

目的探討小分子干擾RNA(siRNA)沉默衰亡加速因子(CD55)基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖的影響。方法針對CD55基因設(shè)計3對siRNA，轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，用實時定量PCR和Western blot檢測CD55 mRNA和蛋白的表達(dá)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。結(jié)果轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞48 h后，3條siRNA中僅siRNA3能顯著抑制CD55 mRNA和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞凋亡比率顯著增加(Plt;0.05)；細(xì)胞增殖率顯著減少(Plt;0.05)；細(xì)胞G1/G0期升高，G2期變化不明顯，S期下降(Plt;0.05)。結(jié)論使用siRNA能夠有效地沉默CD55基因的表達(dá)，并顯著影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

胰腺癌；RNA干擾；CD55；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

胰腺癌為常見消化道惡性腫瘤之一，手術(shù)根治率較低，且對放化療均不敏感，胰腺癌根治性手術(shù)患者的總體術(shù)后的5年生存率lt;5%，迫切需要找到新的治療策略[1- 3]。CD55基因是本實驗室通過基因芯片篩選胰腺癌、癌旁組織找到的差異基因之一，其在多種惡性腫瘤組織及大多數(shù)胰腺癌細(xì)胞系中過量表達(dá)[4- 5]。本實驗用小分子干擾RNA(small interference RNA,siRNA)下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞CD55基因表達(dá)后觀察其對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

胰腺癌BxPC-3細(xì)胞(北京腫瘤研究所)；1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；3對siRNA設(shè)計和合成(廣州銳博生物公司)，其中陰性對照序列由廣州銳博生物公司持有，不對外公開(表1)；Annexin V-PE/7-AAD 試劑盒(BD公司)；熒光實時定量PCR試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTM)(TaKaRa公司)；流式細(xì)胞儀(FACSAria公司)；BrdU染色試劑盒(In Situ Cell Proliferation Kit，F(xiàn)LUOS)(Roche公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)。按照銳博生物公司說明書轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染siRNA、陰性對照siRNA的人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞分別為干擾組、對照組，未轉(zhuǎn)染的人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞為空白組。

1.2.2 Western blot檢測BxPC-3細(xì)胞蛋白的表達(dá)：以RIPA裂解液提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每條泳道加25 μg蛋白電泳分離，以恒定電流持續(xù)轉(zhuǎn)膜約70 min；室溫下以含5%脫脂奶粉的蛋白封閉液持續(xù)封閉2 h，4 ℃兔抗人CD55一抗(1∶200)孵育過夜，以二抗(1∶5 000)室溫振蕩孵育1 h后蛋白封閉液洗膜。加入ECL試劑暗室顯色、曝光。用Image J對膠片半定量分析。

1.2.3 qRT-PCR檢測：消化轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，Trizol裂解法抽提細(xì)胞中總RNA; 以紫外分光光度法測定總RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作合成cDNA,具體反轉(zhuǎn)錄條件如下：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。隨后進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)：按說明書操作。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s；反應(yīng)40個循環(huán)。CD55上、下游引物序列為5′-CATGATTGGAGAGCACTCTATTT ATTG-3′和5′-TTGGTGGGACCTTGGAAGTTAG-3′。β-actin上、下游引物序列為5′-TGAGG CACTCTTCC AGCCTT-3′和5′-CACTTCATGATGGAGTTGAAGGT AGT-3′。樣本目的基因及內(nèi)參基因(β-actin)循環(huán)閾值的差值記作△Ct，選其中一個樣本作為對照樣本，各樣本與對照樣本的△Ct差值記作△△Ct。目的基因相對表達(dá)量記作2-△△Ct。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%時用胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，按AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒說明書操作,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 BrdU流式細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖率：將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%時用胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，按BrdU染色試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖狀態(tài)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期：將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%時用胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，按RNase及PI試劑說明書操作，使用FACSAria公司流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 CD55 siRNA引物序列Table 1 The sequence of CD55 siRNA primer

2 結(jié)果

2.1siRNA對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3CD55表達(dá)的影響

3條siRNA中僅CD55 siRNA-3能顯著抑制CD55 mRNA和蛋白的表達(dá)，選擇CD55 siRNA-3片段進(jìn)行后續(xù)實驗(圖 1，2)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

干擾組細(xì)胞凋亡比率較空白組和對照組顯著增加(Plt;0.05)(表2，圖 3)。

2.3 BrdU細(xì)胞流式檢測細(xì)胞增殖率

干擾組增殖率較空白組和對照組減少(Plt;0.05)(表 3，圖 4)。

*Plt;0.05 compared with NC siRNA圖1 各組細(xì)胞CD55 mRNA表達(dá)及相對抑制率Fig 1 Expression of mRNA in each group and relative inhibitory rate

*Plt;0.05 compared with NC siRNA圖2 各組細(xì)胞CD55蛋白表達(dá)及相對抑制率Fig 2 Expression of protein in each group and relative inhibitory rate

表2 流式細(xì)胞儀檢測BxPC-3細(xì)胞凋亡結(jié)果Table 2 Effect of CD55 gene silencing on apoptosis of BxPC-3 cells by flow cytometry(%,±s，n=3)

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with NC siRNA.

圖3 流式細(xì)胞儀檢測BxPC-3細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig 3 Effect of CD55 gene silencing on apoptosis of BxPC-3 cells by flow cytometry

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

與空白組和對照組相比，干擾組細(xì)胞G1/G0期升高，G2期變化不明顯，S期下降(Plt;0.05)(表 4，圖 5)。

表3 BrdU流式細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖率 Table 3 Effect of CD55 gene silencing on proliferation of BxPC-3 cells by BrdU staining flow cytometry(%, ±s,n=3)

*Plt;0.05 compared with control;#Plt;0.05 compared with NC siRNA.

圖4 BrdU流式細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖率 Fig 4 Effect of CD55 gene silencing on proliferation of BxPC-3 cells by BrdU staining flow cytometry

表4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期Table 4 Effect of CD55 gene silencing on cell cycle of BxPC-3 cells by flow cytometry(%, ±s，n=3)

*Plt;0.05 compared with control;#Plt;0.05 compared with NC siRNA.

圖5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 Fig 5 Effect of CD55 gene silencing on cell cycle of BxPC-3 cells by flow cytometry

3 討論

衰變加速因子(decay accelerating factor,DAF)，又名CD55基因，是作者通過基因芯片技術(shù)[6]篩選到的癌/癌旁腫瘤差異基因之一。CD55幾乎分布于全部細(xì)胞[7]，主要功能是通過抑制補(bǔ)體的經(jīng)典及旁路的激活防止損害宿主自身組織[8]。既往研究已在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上證實乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌的細(xì)胞及食道癌的鱗狀細(xì)胞、甲狀腺的髓質(zhì)CD55過表達(dá)，并且與腫瘤的不良預(yù)后顯著相關(guān)[9]。

既往研究證實DAF表達(dá)可由前列腺素E2經(jīng)G蛋白/CAMP/PKA途徑上調(diào)，作用4 h后在mRNA水平可提高至20倍,而蛋白水平則提高至2倍,且可維持24 h[10]，而前列腺素E2可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和新生。既往研究報道CD55過度表達(dá)在多種癌組織包括胰腺癌細(xì)胞系中[4- 5],具體機(jī)制不清,探討CD55基因的生物學(xué)作用有助于揭示CD55基因在腫瘤發(fā)展中的角色。

小分子干擾技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于基因功能分析和疾病治療研究[11]，本實驗以人胰腺細(xì)胞系BxPC-3作研究對象，針對CD55基因設(shè)計3對siRNA，通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞系，用實時熒光定量PCR和Western blot免疫印跡方法挑選能顯著抑制CD55表達(dá)的siRNA后，并以其轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)觀察到小分子干擾RNA下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞CD55表達(dá)后對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果提示，用小分子干擾RNA抑制后BxPC-3細(xì)胞凋亡率增加，增殖率減小，細(xì)胞G1期升高，G2期變化不明顯，S期下降，與預(yù)期結(jié)果符合。既往研究證明細(xì)胞凋亡、增殖和周期等生物學(xué)行為變化與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[12]，CD55作為腫瘤細(xì)胞信號分子有促腫瘤細(xì)胞增生的作用[13]。人宮頸癌細(xì)胞系中抑制CD55可能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖率減小[14]。本實驗結(jié)果揭示CD55基因表達(dá)可能在一定水平上促進(jìn)胰腺腫瘤細(xì)胞增殖，但是相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步探討。

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Effect of siRNA-mediated silencing of the accelerating factor (CD55) on biological behaviour of human pancreatic cancer cell line BxPC-3

HE Zheng, WU Hui, WAN Rong-hua, ZHENG Jun*

(Dept. of Hepatopancreatobiliary Spleen Surgery, the First Clinical Medical College of Three Gorges University, Yichang 443002, China)

ObjectiveTo study the specific effect of silencing ofCD55 gene by small interfering RNA (siRNA) on the growth of human pancreatic cancer cell line BxPC-3.MethodsThree CD55-specific siRNAs and one negative siRNA were designed and then transfected into human pancreatic cancer cell line BxPC-3 by Lipofectamine 2000.Quantitative real-time PCR(qRT-PCR) and Western blot were used to check the expression of CD55 mRNA and protein respectively. And flow cytometry were used to detect apoptosis, proliferation and cell cycle of target cells.ResultsOne of three CD55-specific siRNAs, siRNA3 silenced the expression of theCD55 gene. The expression of CD55 mRNA and protein remarkably decreased. The cells transfected with siRNA3 were found to increase apoptosis and reduce proliferation significantly(Plt;0.05); the target cells stagnated in phase G1after transfection(Plt;0.05).ConclusionssiRNA-mediated silencing ofCD55 can effectively affect the biological behavior of human pancreatic cancer cell line BxPC-3.

pancreatic carcinoma; RNA interference; CD55; cell apoptosis; cell proliferation; cell cycle

2013- 11- 11

2014- 03- 25

*通信作者(correspondingauthor)： 805226494@qq.com

1001-6325(2014)07-0974-05

研究論文

R 735.9

A