周貽兵，林野，李磊，王婭芳，劉利亞

（貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550004）

高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量

周貽兵，林野，李磊，王婭芳，劉利亞*

（貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550004）

采用高效液相色譜熒光法測定牛奶中的黃曲霉毒素M1。牛奶中的黃曲霉毒素M1用乙腈超聲提取，離心，上清液濃縮后用50mLPBS緩沖液稀釋，過免疫親和層析柱凈化，10%甲醇水溶液10mL淋洗柱，2m L甲醇洗脫，洗脫液氮吹干后，用10%乙腈水溶液1mL蝸旋溶解殘渣，過0.22μm濾膜，上機測定。對加入乙腈比例、淋洗液及洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：m牛奶：V乙腈=1：2有效的沉淀蛋白避免了過柱堵塞問題，提高了過柱效率。用10%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱，能有效的去除掉雜質(zhì)，避免了洗脫液成渾濁現(xiàn)象。該方法的線性范圍寬，回收率為89.1%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%～9.7%之間，檢出限為0.01μg/kg，低于1/10現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)，符合檢測要求，適用于對牛奶中黃曲霉素素M1的檢測。

黃曲霉毒素M1；牛奶；免疫親和層析柱；高效液相色譜法

黃曲霉毒素M1于1993年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，主要表現(xiàn)在致癌、致畸、致突變。黃曲霉毒素M1是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后，在體內(nèi)的肝微粒體單氧化酶系催化下，被羥基化生成的二次毒性代謝產(chǎn)物，存在于動物分泌的乳汁和產(chǎn)生尿液中。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素M1污染的食品之一，對牛奶中黃曲霉毒素M1準(zhǔn)確定量，了解真實污染水平，對維護(hù)人群健康具有重要意義。測定黃曲霉毒素M1的方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫法和薄層色譜法等[1-6]。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性好，檢出限低等優(yōu)點，但儀器價格昂貴，不易在基層實驗室普及，熒光光度法準(zhǔn)確性差，是一種半定量方法，難以普及，酶聯(lián)免疫法為初篩法，易出現(xiàn)假陽性，薄層色譜法所需設(shè)備簡單，但操作繁瑣、靈敏度低等缺點，而高效液相色譜熒光法具有操作簡單、靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點，得到廣泛的應(yīng)用。按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉M1的測定》中液體奶處理方法，過柱凈化過程中易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，在洗脫過程中，洗脫液渾濁，酸奶pH通常低于免疫親和柱的使用范圍，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文選擇乙腈為提取劑，有效沉淀蛋白且提取黃曲霉毒素M1更加充分，經(jīng)離心后得到澄清的提取液，濃縮后用PBS緩沖液稀釋后過柱，避免了pH對測定結(jié)果的影響，大大提高了過柱效率。

1材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters2695型高效液相色譜儀，配Waters2475熒光檢測器，LABOROTA 4001標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，臺式高速冷凍離心機：SiGma公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，超純水機：艾科浦；黃曲霉毒素M1免疫親和柱：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品（0.5μg/mL，PrbioLab公司），水為超純水，乙腈（色譜純）。

PBS緩沖液：稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于900mL超純水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，最后加水定容至1 L即可。

1.2 樣品的提取與凈化

1.2.1 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取10.00 g牛奶于50mL離心管中，加入20mL乙腈，超聲提取10min，1 0000 r/min離心，取出全部上清液于50mL濃縮瓶中，濃縮使?jié)饪s液體積小于2mL，加入50mLPBS緩沖液搖勻，待凈化。

1.2.2 凈化

將上述全部溶液過黃曲霉毒素M1免疫親和柱，用10%甲醇水溶液10mL淋洗，棄去全部流出液，用2mL甲醇洗脫免疫親和柱，收集全部洗脫液于5mL玻璃試管中，在40℃下氮吹干，用V乙腈∶V水=10∶90的溶液溶解殘留物，過0.22μm的濾膜，上機測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm× 5μm）；流動相為25%乙腈水溶液，流速1.0mL/min，激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長：435 nm，進(jìn)樣體積10μL。

2結(jié)果

2.1 工作曲線與檢出限

將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成1.0、5.0、 10.0、20.0、40.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在1.3色譜條件下進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，黃曲霉毒素M1的線性回歸方程為Y=30 900X+75 400（R2=0.999 9），以3 S/N計算方法的檢出限為0.01μg/kg，低于現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)，符合檢測要求。

2.2 加標(biāo)回收率及精密度

向空白牛奶樣品中加兩個濃度水平的黃曲霉毒素M1，每個添加量做6次平行樣，方法的平均回收率在89.1%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%～9.7%之間（見表1）。

表1 方法的加標(biāo)回收率及精密度Table1 The recovery and precision of the method

3討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

乙腈具有沉淀蛋白的作用，本實驗考察了m牛奶∶V乙腈=1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 g/mL時蛋白的沉淀效果。實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈比例越高，蛋白的沉淀效果越好，當(dāng)乙腈與牛奶的比例達(dá)到2以上時，牛奶中的蛋白基本沉淀完全，離心后得到比較澄清的溶液。同時比較了不同乙腈比例對陽性牛奶樣品中黃曲霉毒素M1提取效率見表2。

表2 不同乙腈比例對陽性牛奶樣品中黃曲霉毒素M1測定結(jié)果比較Table2 Comparision of determination result of positive sample extracted by different acetonitrile proportion

表2表明，隨著乙腈加入量的增加，牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的提取效率逐漸增加，m牛奶∶V乙腈=1∶0時，即為國標(biāo)GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉M1的測定》的提取方法，測定結(jié)果偏低，當(dāng)m牛奶∶V乙腈= 1∶2，、1∶3、1∶4時，黃曲霉毒素M1的測定結(jié)果非常接近，當(dāng)乙腈的比例增加時，從而增加了濃縮的時間和處理成本，所以本實驗選擇m牛奶∶V乙腈=1∶2提取牛奶中的黃曲霉毒素M1。

3.2 淋洗液的選擇

提取液過免疫親和柱后，用10mL純水沖洗免疫親和柱，用乙腈或甲醇洗脫后，洗脫液呈乳白色，為了解決此問題，本實驗考察了體積比為5%、10%、15%、20%甲醇水溶液10mL淋洗免疫親和柱。實驗結(jié)果表明：隨著甲醇比例的逐漸增大，洗脫液逐漸變澄清，當(dāng)甲醇比例達(dá)到10%，用乙腈洗脫后溶液基本澄清，但隨著甲醇比例的增大，黃曲霉毒素M1的回收率逐漸降低，綜合考慮本實驗確定淋洗液的比例為10%甲醇水溶液。

3.3 洗脫液的優(yōu)化

將含有25 ng的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液加到免疫親和柱上，過柱后，用10mL 10%甲醇水溶液洗脫雜質(zhì)，分別用1mL～4mL 80%甲醇水溶液、甲醇、乙腈進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，40℃氮吹干，用10%乙腈水溶液1mL溶解殘渣，蝸旋混均，過0.22μm濾膜，上機測定。計算各個上樣體積下的回收率，確定最優(yōu)洗脫條件。

表3 洗脫液及體積對回收率的影響Table3 Effect of different elution solvent and volume on recoveries

從表3可以得出，同種洗脫液，隨著洗脫體積的增加，回收率逐漸增加；不同洗脫液在相同洗脫體積下，甲醇和乙腈回收率較好，當(dāng)使用甲醇或乙腈2mL洗脫黃曲霉毒素M1時，基本洗脫完全，洗脫液的量越大，氮吹耗時越大，甲醇沸點比乙腈低，氮吹消耗的時間越少，綜合考慮，本實驗選擇2mL甲醇為洗脫液。

3.4 pH值對測定結(jié)果的影響

按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定》中將液體奶處理方法，取一定量的液態(tài)奶樣品水浴加熱到35℃～37℃，離心，收集上清液，過免疫親和柱。對于酸奶樣品，上清液的pH通常在5～6之間，偏離免疫親和柱的pH使用范圍6～8，影響抗原抗體的結(jié)合，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，使測定結(jié)果偏低，所以要用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到6～8，再過柱。本文選擇磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，控制溶液的pH在免疫親和柱的使用范圍之內(nèi)，避免調(diào)節(jié)溶液pH的過程。

4結(jié)論

本文利用乙腈對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行提取，有效的沉淀蛋白，避免了過柱堵塞問題，提高了過柱效率，同時乙腈比GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定》中液態(tài)乳的處理方法提取牛奶樣品中黃曲霉毒素M1更加充分，測定結(jié)果更能準(zhǔn)確反映牛奶中黃曲霉毒素M1的污染水平。通過回收率實驗對淋洗液和洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化，找出了淋洗液的最佳比例或體積，解決了洗脫液成渾濁的現(xiàn)象。該方法選擇了PBS緩沖液為稀釋液，有效的控制提取液的酸度在免疫親和柱適用范圍內(nèi)，避免了單個樣品pH調(diào)節(jié)。該方法的線性范圍寬，回收率為89.1%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%～9.7%之間，檢出限為0.01μg/kg，低于1/10現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1限量標(biāo)準(zhǔn)，符合檢測要求，適用于對牛奶中黃曲霉素素M1的檢測。

[1]李佐卿,章再婷,謝東華,等.免疫親和柱高效液相色譜法快速測定牛奶和奶粉中黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2[J].理化檢驗-化學(xué)分冊,2005,41(6)：406-408

[2]張鵬,張瑜.高效液相色譜測定牛奶中黃曲霉毒素M1[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,11(6)：683

[3]王軍淋,蔡增軒,任一平.超高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒夥z測奶及奶制品中黃曲霉毒素M1[J].浙江大學(xué)學(xué)報,2013,39 (2)：191-196

[4]董彬,楊立新,李斌,等.多功能柱凈化液液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2011,10(4)：38-40

[5]陳敏,王穎,顧其芳,等.SNAPTM檢測系統(tǒng)用于篩選牛奶中黃曲霉毒素M1探討[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2004,16(1)：5-6

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.37-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

Determ ination of A flatoxin M1Content in M ilk by High-performance Liquid Chromatography

ZHOU Yi-bing，LINYe，LILei，WANGYa-fang，LIU Li-ya*
（Guizhou Center for Diseases Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China）

Aflatoxin M1in milk were determinated using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.Aflatoxin M1in milk were firstly ultrasonic extracted，centrifuged，concentrated and then purified through immunoaffinity column，using 10%methanol aqueous solution leaching column，dried in nitrogen，volumed by10% acetonitrile aqueous.The ratio of addition acetonitrile，leaching solution and eluent were optimized. The results showed that the results showed that the ratio of the milk sample to acetonitrile was 1 to 2 inmass to volume could effectively precipitateprotein and avoid the column plug. Washing immunoaffinity column with 10 % methanol aqueous can effectivelyremove impurities and avoid the turbid phenomenon of eluent. The recovery of method with widely linearrange was between 89.1 % to 93.5 %，relative standard deviation between 6.5 % to 9.7 % and the detection limit is 0.01μg/kg which was less than1/10of current national food safety standards with limit the quantity of aflatoxin M1. The method can be applied to the determination the content of aflatoxin M1inmilk sample.

aflatoxin M1；milk；immunoaffinity column；high-performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.027

2013-06-26

周貽兵（1985—），男（漢），主管技師，碩士，主要研究領(lǐng)域：食品分析及科研。

*通信作者：劉利亞，男，副主任技師，主要從事于食品分析及科研。