侯曉梅，張敏，楊海龍，*

（1.溫州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江溫州325000；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325027）

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國(guó)名貴的藥用真菌，其子實(shí)體素有“仙草”之稱，具有很高的保健和藥用價(jià)值，衛(wèi)生部已批準(zhǔn)靈芝為食品新資源。靈芝在中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家的應(yīng)用已有2000 多年的歷史，目前在加拿大、美國(guó)等西方國(guó)家也廣受歡迎，據(jù)估計(jì)，全球靈芝產(chǎn)品的市場(chǎng)超過15 億美金[1]。靈芝含有多種化學(xué)成分，如多糖、靈芝酸、甾醇、核苷、生物堿、蛋白質(zhì)、脂肪酸等，其中多糖被認(rèn)為是靈芝的主要活性成分之一，靈芝多糖的研究一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前從靈芝中分離獲得的靈芝多糖超過200種[2]。靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗輻射、抗疲勞等多種生物活性[3-9]。

目前，靈芝的生產(chǎn)主要有固體培養(yǎng)法和深層發(fā)酵法。固體培養(yǎng)方法經(jīng)濟(jì)有效，可以長(zhǎng)出子實(shí)體，且取材方便，是一種有效的獲取靈芝產(chǎn)品的方法；但固體培養(yǎng)法的缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，且較難有效地確定培養(yǎng)終點(diǎn)和嚴(yán)格控制產(chǎn)物的含量和質(zhì)量。深層發(fā)酵方法不受季節(jié)的影響，且液體菌種的培養(yǎng)周期短，成本低，能快速增殖菌體細(xì)胞，活性物質(zhì)的有效成分易于控制，能顯著提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注[5，10-13]。研究表明，液體深層發(fā)酵生產(chǎn)的靈芝多糖與來源于靈芝子實(shí)體、孢子的靈芝多糖具有相似的功效[13-14]，液體深層發(fā)酵技術(shù)是獲取靈芝多糖類化合物的重要手段[5，7，12-15]。

1 培養(yǎng)基

1.1 碳源

靈芝深層發(fā)酵中可利用的碳源包括葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、酒糟等。但不同的菌株對(duì)各種碳源的利用率不同，而且同一菌株生產(chǎn)不同的代謝產(chǎn)物時(shí)亦可能需要不同的最佳碳源，如有研究表明乳糖作為碳源利于產(chǎn)胞外多糖，而葡萄糖有利于產(chǎn)胞內(nèi)多糖[16]。

葡萄糖等單糖是靈芝菌的優(yōu)質(zhì)碳源，但葡萄糖質(zhì)量濃度太高和太低都不利于胞外多糖產(chǎn)率的提高，太低時(shí)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)用于長(zhǎng)菌體的比例增加但葡萄糖質(zhì)量濃度大于60 g/L 時(shí)，延滯期要滯后24 h 左右，產(chǎn)量反而下降，說明較高質(zhì)量濃度碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)具有抑制作用[17]；葡萄糖的濃度一般應(yīng)控制在5%以內(nèi)，羅建成等的研究表明在一定范圍內(nèi)，菌絲體產(chǎn)量和胞外多糖濃度隨葡萄糖含量增大而增大，當(dāng)葡萄糖含量為5%時(shí)產(chǎn)量最高，隨著葡萄糖含量繼續(xù)增加，由于高濃度的葡萄糖對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，產(chǎn)量反而下降[18]；Fang 等的研究亦得到同樣的結(jié)論，50 g/L 的起始葡萄糖濃度最有利于胞內(nèi)、胞外多糖的生產(chǎn)[15]。

蔗糖、乳糖等也是靈芝菌的理想碳源[19-20]；Tang 等的研究表明乳糖是最適于靈芝菌體的生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖的合成，而蔗糖是靈芝胞外多糖合成的最佳碳源[20]。

復(fù)合碳源具有原料來源豐富、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，研究表明玉米粉有利于菌絲體的生長(zhǎng)和胞外糖肽的生產(chǎn)[21]。靈芝菌可分泌淀粉酶，能利用淀粉為原料進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，而且在靈芝液體發(fā)酵時(shí)，靈芝菌絲體往往形成菌球，玉米淀粉等的存在還能為菌絲體提供附著物，從而有利于菌體的生長(zhǎng)。在發(fā)酵時(shí)大多使用葡萄糖與淀粉類物質(zhì)共同作為碳源，葡萄糖與玉米粉配合作為碳源，多糖產(chǎn)量較高，原因可能是玉米粉中含有維生素、纖維素、核苷酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，有利于菌絲體的生長(zhǎng)和多糖的積累與分泌[22]。

1.2 氮源

相對(duì)于無機(jī)氮源，靈芝對(duì)有機(jī)氮源利用更迅速，采用有機(jī)氮源有利于提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率和最終生物量，并可促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。一般靈芝適用的有機(jī)氮源有酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅粉、麩皮等。研究表明蛋白胨有利于多糖的生產(chǎn)[16]；豆粕粉最適合靈芝菌絲生長(zhǎng)，尿素最適合靈芝胞外糖肽生產(chǎn)[21]；對(duì)于靈芝深層發(fā)酵，有時(shí)采用配合氮源更有利于菌體的生長(zhǎng)代謝，方慶華等的研究表明同時(shí)添加5 g/L 蛋白胨和10 g/L酵母膏條件下細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最大（15.8 g/L），胞內(nèi)多糖產(chǎn)量也達(dá)到最大（0.858 g/L），但胞外多糖產(chǎn)量在同時(shí)添加5 g/L 蛋白胨和5 g/L 酵母膏條件下達(dá)到最大，達(dá)0.805 g/L[23]。常景玲等研究后認(rèn)為以蛋白胨與麩皮配合氮源，靈芝多糖產(chǎn)量最高[22]。胡煥榮認(rèn)為氮源是靈芝菌絲體主要物質(zhì)，氮源過少會(huì)導(dǎo)致菌絲體生命力較弱，出現(xiàn)菌絲體提前自溶，在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中除玉米粉、豆粕粉中帶入的氮源外，再采用酵母膏補(bǔ)充氮源，有利于靈芝菌絲體的生長(zhǎng)及多糖的生產(chǎn)[24]。

由于研究菌株的不同，也有研究認(rèn)為無機(jī)氮源亦可促進(jìn)靈芝代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，梁海秋研究了靈芝2165的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，硝酸銨為氮源時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量最高，達(dá)3.422 g/L，胰蛋白胨和硫酸銨次之，大豆粉也不錯(cuò)，尿素和大豆蛋白胨較差[25]。

使用復(fù)合碳、氮源由于有原料來源豐富、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)化生產(chǎn)的首選，劉高強(qiáng)等采用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)曲面法獲得多糖發(fā)酵的最優(yōu)配方為：玉米粉19.6 g/L，麩皮粉11.0 g/L，豆餅粉6.7 g/L，蔗糖19.1 g/L，150 L 發(fā)酵罐中試放大結(jié)果表明，多糖產(chǎn)量為1.86 g/L[26]。

1.3 無機(jī)鹽

靈芝菌絲體生長(zhǎng)需要礦質(zhì)元素，如鐵、鎂、磷、鉀、鈉、銅、錳、鉬、鉻等。研究表明K+、Mg2+和Fe2+可以促進(jìn)靈芝多糖液態(tài)發(fā)酵，在種子液培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0.2%Fe2+更有利于靈芝多糖產(chǎn)量的提高[27]。

Hsieh 等的研究結(jié)果顯示缺乏磷酸鹽可顯著降低菌絲體中多糖含量，而限制鎂離子供應(yīng)則能得到大分子量的低產(chǎn)量多糖[28]。陳志杰等采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取葡萄糖、蔗糖、玉米漿干粉、蛋白胨、黃豆芽汁、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、ZnSO4·7H2O、VB1、谷氨酸鈉等對(duì)靈芝生長(zhǎng)及產(chǎn)胞外多糖相關(guān)因子進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明蔗糖、KH2PO4和MgSO4對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)及靈芝產(chǎn)胞外多糖具有顯著影響[29]。

一般在靈芝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，往往使用自來水及玉米淀粉、酵母膏等復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)成分，在這些營(yíng)養(yǎng)成分中含有靈芝生長(zhǎng)代謝所需的大部分無機(jī)鹽，一般情況下，只要在培養(yǎng)基中加入磷酸二氫鉀（0.1%～0.2%），硫酸鎂（0.05%～0.15%）就能達(dá)到靈芝菌絲體的生長(zhǎng)要求[24]。

1.4 生長(zhǎng)因子及促進(jìn)劑

玉米粉、酒糟、糖密等復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)有利于靈芝菌的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，其中原因之一就是這些營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中含有維生素等生長(zhǎng)因子。目前研究的靈芝發(fā)酵生長(zhǎng)因子及促進(jìn)劑主要包括維生素、植物油、醇類物質(zhì)等。研究表明在一定濃度范圍內(nèi)，VB1能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)和提高多糖產(chǎn)量，肖雷等認(rèn)為以添加10 mg/L濃度的效果最佳[17]；而胡煥榮認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入VB150 mg/L 能促使菌絲體生長(zhǎng)粗狀[24]。張華山等的研究認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加VB5作為生長(zhǎng)因子能更好地促進(jìn)多糖的合成，效果優(yōu)于VB1[16]。

在一定含量范圍內(nèi)，三十烷醇能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)并提高多糖產(chǎn)量，其中以添加1 mg/L 三十烷醇的效果最佳，這可能是由于三十烷醇在一定含量范圍內(nèi)能改善細(xì)胞的通透性所致[18]。其它小分子醇類也有類似的作用，Yang 等的研究表明在培養(yǎng)基中添加1.5%的乙醇或丙醇亦可促進(jìn)靈芝菌絲體的生長(zhǎng)及其胞外多糖的生產(chǎn)[30]。

在靈芝菌的工業(yè)發(fā)酵過程中，由于菌體、蛋白等成分的存在會(huì)產(chǎn)生泡沫，往往需在培養(yǎng)基中添加一定量的植物油，研究表明在培養(yǎng)基中加入1%的豆油、花生油、紅花子油、玉米油、葵花子油、橄欖油可不同程度地促進(jìn)靈芝菌的生長(zhǎng)，除豆油外，其它植物油均可促進(jìn)胞外多糖的合成[10]；Chang 等的研究亦表明紅花子油（3.44 g/L）能顯著促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，橄欖油（3.96 g/L）可提高多糖的合成[19]。Yang 等還研究了脂肪酸對(duì)靈芝菌發(fā)酵的影響，表明在0.3 g/100 mL 添加量?jī)?nèi)，棕櫚酸、油酸可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)及胞外多糖的合成，硬脂酸在低添加量（0.1 g/100 mL）亦可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)及胞外多糖的合成，而亞油酸對(duì)靈芝菌的生長(zhǎng)代謝有抑制作用[10]。

一些中藥成分對(duì)靈芝菌的深層發(fā)酵具有顯著影響，并能促進(jìn)靈芝菌活性產(chǎn)物的生物合成。黨參、枸杞、山藥、薏苡仁、蘆薈等中藥的水提物（187.5 g 生藥/L 水提液）可促進(jìn)靈芝菌的生長(zhǎng)；薏苡仁、黨參、山藥、牛膝的醇提物可促進(jìn)靈芝菌的生長(zhǎng)及胞外多糖的生產(chǎn)[31]；Liu 等的研究表明藥用昆蟲蜣螂在添加量為5 g/L 時(shí)能顯著促進(jìn)靈芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖的形成（P＜0.05），胞內(nèi)多糖和胞外多糖的產(chǎn)量分別由對(duì)照的（1.93±0.09）g/L 和（520.3±20.2）mg/L 提高到（2.41±0.12）g/L 和（608.9±20.2）mg/L，但添加蜣螂發(fā)酵后，靈芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖主要組分的合成途徑并未改變[32]。

2 培養(yǎng)條件

2.1 接種量與菌齡

菌齡太小，接種后的延滯時(shí)間變長(zhǎng)，發(fā)速時(shí)間拉長(zhǎng)，菌齡太老，菌絲容易老化自溶，都不利于靈芝菌的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，一般靈芝菌的菌齡以4 d～5 d比較適合[18]。

接種量的大小決定了菌體的生長(zhǎng)速度。靈芝深層發(fā)酵一般的接種量以5%為宜[17-18]；李平凡等的結(jié)果顯示8%～10%最佳[33]；胡煥榮認(rèn)為在發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)接種量在10%可大大提高了設(shè)備的利用率，降低了發(fā)酵周期，減少了雜菌污染機(jī)會(huì)[24]；不同的發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)時(shí)可能需要不同的接種量，方慶華等的研究認(rèn)為表明低的接種量有著較高的平均生長(zhǎng)速度，但是其多糖產(chǎn)量較低；在接種量為170 mg/L 條件下胞內(nèi)和胞外多糖的產(chǎn)量分別為0.699 g/L 和0.670 g/L，而高的接種量有利于多糖的秤，在接種量為670 mg/L 條件下胞內(nèi)和胞外多糖的產(chǎn)量卻分別達(dá)到1.220 g/L 和0.874 g/L[23]。

2.2 pH

靈芝菌可在較寬的pH 范圍（3～7.5）生長(zhǎng)[11]，但以微酸性（pH 為5.5～6.5）為最佳，當(dāng)pH 低于3.5，菌絲體生長(zhǎng)緩慢，甚至停止生長(zhǎng)并產(chǎn)生自溶現(xiàn)象[24]。但不同菌株的最適pH 差異非常大，如紫芝胞外多糖發(fā)酵在初始條件設(shè)為pH 5.4 時(shí)產(chǎn)生最多，而赤芝、甜芝胞外多糖的發(fā)酵產(chǎn)量不受初始pH 試驗(yàn)范圍的影響；赤芝、紫芝在初始pH 4.8 條件下發(fā)酵胞內(nèi)多糖積累最少，而甜芝此條件下發(fā)酵胞內(nèi)多糖積累最多[34]。

菌絲體的生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的最適pH 并不一致。Babitskaya 等的研究表明pH 6～7 最適宜菌體生長(zhǎng)，pH 6～4 有利于胞內(nèi)及胞外多糖的合成[11]，Chang 等獲得了類似的研究結(jié)果，菌體生長(zhǎng)最適pH6.5，多糖為5.5～6.5[19]；李平作等研究了靈芝發(fā)酵過程中pH 的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)起始pH 為5.5 有利于菌體生長(zhǎng)及多糖的合成，pH 控制在5.5 時(shí)生物量最大，但多糖產(chǎn)量最低；若在發(fā)酵過程中控制pH 在4.0 時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高，較未控制提高24%[35]；然而，Yang 等認(rèn)為pH 4～4.5 最有利胞外多糖的合成，控制pH 恒定在4 不利于多糖的合成[36]；Fang 等的研究表明pH 6.5 時(shí)最有利于靈芝菌體生長(zhǎng)，將pH 從6.5 降至3.5 有利于胞內(nèi)及胞外多糖的生產(chǎn)[37]。毛健等采用分階段的pH 控制策略，初始pH 6.0，菌體生長(zhǎng)前期（0 h～40 h）控制pH 為5.5，40 h～48 h 控制pH 5.0，48 h 后至發(fā)酵結(jié)束控制pH4.5，靈芝胞外多糖最高達(dá)到3.23 g/L[38]。

2.3 溫度

靈芝發(fā)酵的生長(zhǎng)溫度范圍較廣，靈芝菌在22 ℃～35 ℃內(nèi)都可以生長(zhǎng)。但生長(zhǎng)的最佳溫度范圍要窄一些，而且不同的菌株亦不一樣，胡煥榮認(rèn)為溫度是菌絲體中酶反應(yīng)的必須條件，在高溫條件下酶反應(yīng)快，菌絲體生長(zhǎng)也快，但菌絲體容易衰老，不易積蓄多糖。在低溫條件下，各種酶反應(yīng)不協(xié)調(diào)，菌絲體也就停止生長(zhǎng)，靈芝菌最佳生長(zhǎng)溫度為（27±1）℃[24]；肖雷等的研究表明靈芝菌在25 ℃～30 ℃生長(zhǎng)勢(shì)良好，28 ℃是生長(zhǎng)的最適溫度[11，17-18]。稍高的溫度有利于靈芝代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，Yang FC 等認(rèn)為30 ℃～35 ℃適宜靈芝菌生長(zhǎng)及胞外多糖的合成[36]；Chang MY 等認(rèn)為最適菌體生長(zhǎng)與多糖合成的溫度為34 ℃[19]。

2.4 通風(fēng)與攪拌

靈芝多糖的發(fā)酵在實(shí)驗(yàn)室常在搖瓶中完成，而工業(yè)生產(chǎn)則在不同規(guī)格的發(fā)酵罐中完成。菌絲體深層發(fā)酵過程中氧氣過多過少都會(huì)影響菌絲體生長(zhǎng)，而培養(yǎng)基中溶解氧與通風(fēng)量、罐壓、攪拌的轉(zhuǎn)速有關(guān)，通風(fēng)量過大，易導(dǎo)致菌絲體衰老，并增加雜菌帶入的機(jī)會(huì)；罐壓過高，二氧化碳的含量增加，抑制靈芝菌絲體生長(zhǎng)；攪拌的轉(zhuǎn)速過快，導(dǎo)致菌絲體纖維組織損壞，培養(yǎng)基的稠密度增加，影響氧氣在培養(yǎng)基中的溶解度。胡煥榮確認(rèn)發(fā)酵罐操作條件為通風(fēng)量在1：0.3 m3/m3·h～0.5 m3/m3·h，罐壓0.5 kg/cm2，轉(zhuǎn)速90 r/min 左右，靈芝菌絲體生長(zhǎng)條件最佳[24]。孫金旭等在7 L 發(fā)酵罐中得出靈芝真菌培養(yǎng)的最佳工藝為轉(zhuǎn)速200 r/min、通氣量200 L/h，在此條件下菌絲體最大產(chǎn)量達(dá)7.35 g/L，胞外多糖干重最高產(chǎn)量達(dá)0.92 g/L[39]。

靈芝菌是好氧真菌，對(duì)培養(yǎng)基中的溶氧進(jìn)行調(diào)節(jié)，控制溶在較高水平有利于菌體生長(zhǎng)及多糖的合成，發(fā)酵控制在最適溶氧80%水平時(shí)，生物量、胞內(nèi)多糖、胞外多糖可比不控制條件下分別提高46%、44%和21%[38]。

3 展望

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵技術(shù)的已取得較大進(jìn)展，在發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和發(fā)酵過程的優(yōu)化等方面作了大量研究，研發(fā)了二階段pH 控制[39]、補(bǔ)料-分批發(fā)酵[12]、補(bǔ)料與三階段光照相結(jié)合[40]等發(fā)酵工藝，篩選了植物油、脂肪酸、醇類、表面活性劑、中藥提取物等外源促進(jìn)劑以提高靈芝多糖的生物合成[10，19，30-32]。但目前對(duì)靈芝發(fā)酵促進(jìn)劑的研究還只停留在種類篩選、添加濃度及對(duì)活性成分生物合成促進(jìn)效果的分析，而對(duì)其促進(jìn)機(jī)理的研究尚在起步階段。另外，有關(guān)高等真菌多糖生物合成代謝途徑及其調(diào)控方面的研究基本是一片空白，靈芝多糖的研究也主要集中在靈芝多糖的分離、結(jié)構(gòu)鑒定、藥理作用，以及培養(yǎng)技術(shù)方面，國(guó)內(nèi)外尚未見靈芝菌多糖合成代謝途徑及其調(diào)控方面的研究。靈芝子實(shí)體和菌絲體產(chǎn)生的多糖在結(jié)構(gòu)、活性上不盡相同，發(fā)酵促進(jìn)劑提高靈芝多糖發(fā)酵生產(chǎn)機(jī)理以及靈芝多糖合成過程的解析應(yīng)是靈芝多糖發(fā)酵研究的重要內(nèi)容，加強(qiáng)這些方面的研究，實(shí)現(xiàn)靈芝多糖生物合成的定向調(diào)控，可促進(jìn)高活性靈芝多糖組份的發(fā)酵生產(chǎn)。

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