董白霞，葉存喜，包永琴，魏玉華，崔月先，閻雪梅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，國家級臨床重點(diǎn)專科，河北省眼病重點(diǎn)實(shí)驗室，河北 石家莊 050000)

作為糖尿病并發(fā)癥之一的糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)嚴(yán)重威脅患者的生存質(zhì)量。近年來，國外研究多關(guān)注篩選藥物[1-2]，但是選擇動物模型更重要。以往的模型僅存在背景期病變，用于病因病機(jī)研究[3]；有的模型也發(fā)現(xiàn)增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)樣改變[4]，但周期長，應(yīng)用受限；局部注射血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[5]或重組VEGF腺病毒載體蛋白[6]的模型很難排除局部毒性作用。眾所周知，VEGF在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起了主導(dǎo)作用。我們成功建立了一種理想的PDR動物模型[7]。本研究著重電鏡觀察該模型視網(wǎng)膜各層的超微結(jié)構(gòu)損害，并與單純鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射的DR模型對比，明確其應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物來源：選擇健康SD大鼠44只，8周齡，體質(zhì)量180～250g，雌雄各半，購自河北省實(shí)驗動物中心。

1.2 分組：

1.2.1 糖尿病組：32只大鼠腹腔注射STZ；每周測血糖≥13.9mmol/L確定為糖尿病鼠，成模24只。未成模8只淘汰。再將24只糖尿病鼠分成2組。STZ傳統(tǒng)造模組糖尿病大鼠12只，腹腔注射STZ后1個月等量生理鹽水雙眼玻璃體注射。STZ聯(lián)合VEGF造模組糖尿病大鼠12只，腹腔注射STZ后1個月0.05μgVEGF(美國Sigma公司)雙眼玻璃體注射。

1.2.2 正常組：12只大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

以上模型制造后分析比較眼底熒光素血管造影、光鏡觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況及免疫組織化學(xué)CD105標(biāo)記視網(wǎng)膜增殖血管內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)STA聯(lián)合VEGF造模組模型鼠具備PDR的特征[7]。

1.3 方法：對STZ聯(lián)合VEGF造模組、STZ傳統(tǒng)造模組不同病程取材進(jìn)行視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察，并與正常組對照。玻璃體注射生理鹽水或VEGF后2周、4周、8周、正常組時846復(fù)合麻醉劑(0.4mL/kg)肌內(nèi)注射全麻后各取1只鼠眼視網(wǎng)膜做電鏡切片，觀察各組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變。并進(jìn)行比較，以明確STZ聯(lián)合VEGF造模組糖尿病大鼠PDR模型的應(yīng)用價值。

2 結(jié) 果

視網(wǎng)膜組織病理學(xué)電鏡觀察結(jié)果如下。

2.1 正常組：色素上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見初級和次級溶酶體、線粒體及少量色素顆粒，視細(xì)胞外節(jié)膜盤排列整齊，無碎裂、溶解現(xiàn)象；內(nèi)核層由外向內(nèi)依次分布著水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞，雙極細(xì)胞體積較大，核大質(zhì)少，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體積最大，單行排列形成視網(wǎng)膜最內(nèi)層細(xì)胞(圖1A)。

2.2 2周時STZ傳統(tǒng)造模組：視細(xì)胞內(nèi)節(jié)內(nèi)線粒體腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖1B)。

2.3 4周時STZ傳統(tǒng)造模組：視細(xì)胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解(圖1C)；雙極細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹。

2.4 8周時STZ傳統(tǒng)造模組：色素上皮細(xì)胞微絨毛少、短，胞漿內(nèi)無脂滴；內(nèi)網(wǎng)層神經(jīng)細(xì)胞突起內(nèi)局部輕水腫，輕于8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組 (圖1D)。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體空泡化。

2.5 2周時STZ聯(lián)合VEGF造模組:視細(xì)胞內(nèi)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空泡化(圖2A);雙極細(xì)胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫;內(nèi)網(wǎng)層空泡變；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空泡化，胞漿液化、溶解。

2.6 4周時STZ聯(lián)合VEGF造模組：視細(xì)胞外節(jié)膜盤溶解較重(圖2B)，但內(nèi)節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細(xì)胞外間隙水腫較2周時STZ聯(lián)合VEGF造模組嚴(yán)重，細(xì)胞核外膜部分?jǐn)嗔?；?nèi)核層雙極細(xì)胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張。

2.7 8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組：視桿及視錐層溶解、消失；內(nèi)、外核層變??；可見到碎裂的視桿細(xì)胞胞核固縮(圖2C)；外網(wǎng)層消失；內(nèi)網(wǎng)層空泡化，胞漿液化、水腫，樹突內(nèi)線粒體腫脹、空泡化(圖2D)；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)液化、溶解，線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。病變重于4周時STZ聯(lián)合VEGF造模組。

圖1 正常組及STZ傳統(tǒng)造模組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜電鏡結(jié)構(gòu)改變

A.正常組視細(xì)胞外節(jié)膜盤排列整齊，無碎裂和溶解(×8 000);B.2周時STZ傳統(tǒng)造模組光感受器細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(×10 000);C.4周時STZ傳統(tǒng)造模組視細(xì)胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解(×8 000);D.8周時STZ傳統(tǒng)造模組內(nèi)網(wǎng)層神經(jīng)細(xì)胞突起內(nèi)水腫程度輕于8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組(×6 000)

圖2 STZ聯(lián)合VEGF造模組糖尿病大鼠電鏡結(jié)構(gòu)改變

A.2周時視細(xì)胞內(nèi)外節(jié)連接處(×20 000);B.4周時外節(jié)膜盤嚴(yán)重溶解(×6 000);C.8周時外核層溶解、消失，內(nèi)外核層變薄，外網(wǎng)層消失(×3 000)；D.8周時內(nèi)網(wǎng)層空泡化，胞漿液化、水腫，胞體樹突內(nèi)線粒體腫脹、空泡化(×3 000)

3 討 論

常用的DR動物模型有以下5種：自發(fā)性遺傳性糖尿病動物模型、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)糖尿病動物模型[8]、胰腺切除糖尿病動物模型、半乳糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)DR動物模型、VEGF局部注射DR動物模型。均可模擬背景型DR，但PDR很難出現(xiàn)[9]。

單純局部注射VEGF造模方法忽略了血糖升高的過程，沒有在造成糖尿病的基礎(chǔ)上局部注射VEGF，很難模擬DR的發(fā)生發(fā)展過程。更為重要的是，視網(wǎng)膜出現(xiàn)病變的時間較短，不能排除其視網(wǎng)膜病變是由于VEGF局部高劑量或高濃度應(yīng)用對視網(wǎng)膜血管組織所致的毒性反應(yīng)。

董宇等[10]應(yīng)用Wistar大鼠腹腔注射STZ 40mg/kg后給予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)4周僅僅出現(xiàn)了毛細(xì)血管基底膜增厚、斷裂缺失、電子密度不均；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變形，核形態(tài)不規(guī)則，異染色質(zhì)靠邊聚集，線粒體空化，嵴斷裂；周細(xì)胞線粒體腫脹變形、空化。基于上述原因，我們在前期研究中成功建立了PDR動物模型[7]，為了進(jìn)一步描述模型的可靠性，本研究主要觀察其超微結(jié)構(gòu)的改變，以驗證其應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果顯示，2周時STZ傳統(tǒng)造模組視細(xì)胞內(nèi)節(jié)內(nèi)線粒體腫脹、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，其余各層接近正常。2周時STZ聯(lián)合VEGF造模組出現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)的損傷，視細(xì)胞內(nèi)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空泡化;雙極細(xì)胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、空泡化，胞漿液化、溶解。4周時STZ傳統(tǒng)造模組視細(xì)胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解；雙極細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹。4周時STZ聯(lián)合VEGF造模組視細(xì)胞外節(jié)膜盤溶解較重，但內(nèi)節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細(xì)胞外間隙水腫較2周時STZ聯(lián)合VEGF造模組嚴(yán)重，細(xì)胞核外膜部分?jǐn)嗔?；?nèi)核層雙極細(xì)胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張。8周時STZ傳統(tǒng)造模組色素上皮細(xì)胞微絨毛少、短，胞漿內(nèi)無脂滴；內(nèi)網(wǎng)層神經(jīng)細(xì)胞突起內(nèi)局部輕水腫，較8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組輕，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體空泡化；8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組視桿及視錐層溶解、消失，內(nèi)、外核層變薄，可見到碎裂的視桿細(xì)胞胞核固縮，外網(wǎng)層消失，胞漿液化、水腫，樹突內(nèi)線粒體腫脹、空泡化，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)液化、溶解，線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，病變重于4周時STZ聯(lián)合VEGF造模組。由此可見，STZ聯(lián)合VEGF造模組視網(wǎng)膜各層組織超微結(jié)構(gòu)的損害明顯重于STZ傳統(tǒng)造模組；2、4、8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組之間比較，4周時病變明顯重于8周，而8周時STZ聯(lián)合VEGF造模組出現(xiàn)了視網(wǎng)膜萎縮的改變。表明聯(lián)合注藥的造模方法不僅可以出現(xiàn)PDR，還可以縮短研究周期，是一種適合于臨床藥物篩選的理想動物模型。

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