董立華，郭盼盼，郭 棟，閆文英，王春英*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017；2.華北制藥集團(tuán)公司新藥研究開發(fā)中心，河北 石家莊 050010)

苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)為蓼科植物何首烏中的主要成分，它具有抗氧化、降血脂、抑制骨質(zhì)疏松[1]、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增生[2]、神經(jīng)保護(hù)[3]、心肌保護(hù)[4]、改善動脈硬化及加速血流[5]等作用。從結(jié)構(gòu)上看，THSG存在順反異構(gòu)體，在自然條件下主要以反式二苯乙烯苷(trans-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，trans-THSG)存在，有實驗[6]表明在光照的誘導(dǎo)下反式結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)化成順式二苯乙烯苷(cis-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，cis-THSG)。許多藥物因為異構(gòu)體的存在而顯示出不同的藥理活性，然而以往對何首烏中二苯乙烯苷的探索都是以trans-THSG為研究對象而忽視了cis-THSG的存在。為了進(jìn)一步對cis-THSG進(jìn)行體內(nèi)外的深入研究，首先要獲得足夠量的cis-THSG及其純品。由于cis-THSG沒有市售的對照品，且何首烏藥材中cis-THSG的含量很少，通過分離提取也很難獲得。本研究旨在通過優(yōu)化光催化作用的條件，使trans-THSG轉(zhuǎn)變成cis-THSG，采用制備液相技術(shù)[7]獲得cis-THSG的純品(≥98.0%)，并以四大光譜聯(lián)用進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1 儀器與試藥

3200 QTRAP 型串聯(lián)四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀，配有Turbo V離子源(美國AB公司)，紫外分光光度計TU-1901(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，磁共振儀(美國Bruker公司)，紅外分光光度計FTIR-8400S(日本島津)，高效液相色譜儀(美國Agilent 1200，二極管陣列檢測器)，紫外燈250 W-L 130 mm(北京中瑞達(dá)電光源廠)，LG16-B型離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)，冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)。

trans-THSG對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號0844-1005)，trans-THSG(本研究室從何首烏中分離提取，經(jīng)測定純度為98.5%)，色譜甲醇(J.T.-Baker)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱 Diamonsil C18柱(分析250mm×4.6mm,5μm；制備250mm×10.0mm,5μm；預(yù)柱7.6mm×4.6mm，5μm)；流動相甲醇(A)-水(B)，梯度程序如下，0～1min、5%～30% A，1～10min、30%～72% A，10～11min、72%～95% A，11～14min、保持95% A；每次進(jìn)樣前先以5% A預(yù)平衡10min；檢測波長285nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃；分析進(jìn)樣量20μL，制備進(jìn)樣量100μL。結(jié)構(gòu)圖見圖1，色譜圖見圖2。

圖1 trans-THSG和cis-THSG的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 高效液相色譜圖

2.2 轉(zhuǎn)化條件的考察

2.2.1 光照條件的選擇：精密稱定trans-THSG適量于量瓶中，用水溶解并稀釋成濃度為0.1g/L的溶液。分別精密量取9份相同體積的溶液于大小形狀都相同的小燒杯中，各取3份分別在日光、254nm紫外光和365nm紫外光下照射，20min后取出放冷，用水補(bǔ)足失重，搖勻，以14 000r/min離心10min，取上清液分別注入液相色譜儀進(jìn)行測定。根據(jù)各組cis-THSG的峰面積平均值進(jìn)行分析，結(jié)果表明，trans-THSG在254nm紫外燈下照射幾乎沒有轉(zhuǎn)化，在日光下照射轉(zhuǎn)化率較少，而在365nm紫外燈下照射時的轉(zhuǎn)化率最大，因此選擇365nm紫外光照射。

2.2.2 溶劑的選擇：分別用水和甲醇為溶劑配制濃度為0.1g/L的trans-THSG溶液，在365nm紫外燈下照射20min，取出放冷后分別用水和甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以14 000r/min離心10min，取上清液，用水稀釋后分別注入液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)cis-THSG的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，溶劑為水和甲醇時，其峰面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于甲醇毒性比較大，且甲醇為溶劑進(jìn)行色譜分離時存在較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)，因此我們最終選擇了以水作溶劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.2.3 初始濃度及光照時間的選擇：配制trans-THSG的系列濃度水溶液，0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L，每個濃度6份，分別在365nm紫外燈下照射5、10、15、20、25、30min，取出放冷，用水補(bǔ)足失重，搖勻，按trans-THSG的初始濃度計，各溶液稀釋至相同濃度，以14 000r/min離心10min，取上清液注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄cis-THSG的峰面積，間接評價轉(zhuǎn)化率的高低。結(jié)果表明，低濃度時隨著光照時間的延長，轉(zhuǎn)化率越來越低(圖3A)，而高濃度時隨著光照時間的延長，轉(zhuǎn)化率越來越高(圖3B)。為了比較各溶液中cis-THSG的濃度高低，我們用峰面積乘以稀釋倍數(shù)作為各轉(zhuǎn)化后溶液的表觀峰面積(圖4)。通過對圖3，4綜合分析，初始濃度為6.0g/L，照射時間為20min時，具有較高的轉(zhuǎn)化率和制備效率。

2.3 cis-THSG的制備：稱取trans-THSG，用水溶解成濃度為6.0g/L的溶液，在365nm紫外燈下照射20min，以14 000r/min離心10min，取上清液注入液相色譜儀進(jìn)行分離制備。分別收集cis-THSG和trans-THSG的流分，前者經(jīng)50℃減壓蒸餾，剩余物用水溶解后冷凍干燥得白色固體粉末(cis-THSG)。避光密封保存于-20℃冰箱中備用。后者按相同方法回收后，重復(fù)上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分離。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定：質(zhì)譜條件，源噴射電壓-4 500V，氣簾氣1.03×105Pa，霧化氣1.03×105Pa，解簇電壓 (DP)-38V(trans-THSG和cis-THSG)，碰撞電壓 (CE) -48 eV (trans-THSG和cis-THSG)。分別取trans-THSG和cis-THSG適量，50%甲醇溶解，針泵進(jìn)樣，分別得到一級、二級質(zhì)譜圖(圖5)，由圖中可知，cis-THSG與trans-THSG具有相同的準(zhǔn)分子離子m/z 405.1[M-H]，表明二者具有相同的分子量。對準(zhǔn)分子離子m/z 405.1[M-H]進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到相同的丟失一個糖基的碎片離子m/z 243.1[M-C6H11O5]及其他相同的碎片離子，如m/z 225.1、173.0、145.2、137.1和109.0，表明二者具有相同的裂解規(guī)律。

圖3 初始濃度及光照時間對轉(zhuǎn)化率的影響

A.低濃度；B.高濃度

Figure 3 Effect of incipient concentration and illumination time on conversion

A.Low concentration;B.High concentration

圖4 各濃度下表觀峰面積隨時間的變化

Figure 4 Changes in the concept of apparent peak area of each concentration with time

圖5 質(zhì)譜圖

A.trans-THSG一級質(zhì)譜圖；B.cis-THSG一級質(zhì)譜圖；C.trans-THSG二級質(zhì)譜圖；D.cis-THSG二級質(zhì)譜圖

Figure 5 Mass spectra

A.First order mass spectrum of trans-THSG;B.First order mass spectrum of cis-THSG;C.Second order mass spectrum of trans-THSG;C.Second order mass spectrum of cis-THSG

核磁共振數(shù)據(jù)及歸屬如下：1H-NMR[500 MHz,CD3OD]δ，3.20(m,1H,C2″-H),3.38 (dd,J=9.0 Hz,1H,C5″-H),3.45 (t,J=9.0 Hz,1H,C4″-H),3.48 (t,J=9.0Hz,1H,C3″-H),3.69-3.79(m,2H,C6″-H),4.57 (d,J=8.0Hz,1H,C1″-H),6.14 (d,J=3.0Hz,1H,C4-H),6.23(d,J=3.0Hz,1H,C6-H),6.48 (d,J=12.0 Hz,1H,β-H),6.61(d,J=8.5Hz,2H,C3′,5′-H),6.72 (d,J=12.0Hz,1H,α-H),7.06 (d,J=8.5 Hz,2H,C2′,6′-H)。其中δ 6.48(d,1H) 和6.72(d,1H) 的耦合常數(shù)為12.0Hz，與反式耦合常數(shù)16.5 Hz不同，可以說明這兩個不飽和碳上的質(zhì)子信號為順式雙鍵質(zhì)子信號。

13C-NMR[125MHz,CD3OD]δ：62.2 (C6″),71.0 (C4″),75.4(C2″),77.9(C3″),78.3(C5″),103.7 (C1″),107.6(C4),108.2(C6),115.9(C3′,C5′),125.5(C1),129.8 (Cα),131.3(C1′),131.4 (C2′,C6′),133.9(Cβ),137.8(C2),151.8(C5),155.3(C3),157.7(C4′)。

紫外全掃描圖譜結(jié)果顯示其最大吸收波長由trans-THSG的320nm移至285nm處(圖6)，與文獻(xiàn)報道一致[8]。

圖6 紫外掃描光譜 (50mg/L水溶液)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

Figure 6 UV scanning spectra (50mg/L aqueous solution)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

紅外光譜數(shù)據(jù)(KBr,cm-1):3 500和3 200 (νO-H)，2 924和2 885 (νC-H)，1 609和1 514(νC-C)，1 456(δC-H)，690 (γ=C-H) 其中690cm-1為順式烯烴面外振動的標(biāo)志，而反式烯烴的面外振動在970cm-1。

根據(jù)上述四大光譜解析，可知制備得到的化合物即為目標(biāo)化合物cis-THSG。

3 討 論

3.1 轉(zhuǎn)化條件的總體分析：本研究結(jié)果表明，低濃度時隨著光照時間的延長，trans-THSG轉(zhuǎn)化為cis-THSG的轉(zhuǎn)化率越來越低，而高濃度時隨著光照時間的延長，轉(zhuǎn)化率越來越高；而各溶液中trans-THSG的量均隨時間呈下降趨勢。其原因可能與苷類化合物降解有關(guān)，且符合濃度越小越容易發(fā)生降解的普遍規(guī)律。雖然在色譜圖中觀察不到明顯的降解物峰，但是很可能會影響目標(biāo)物峰的純度，轉(zhuǎn)化時間也不易過長。因此在保證一定的轉(zhuǎn)化率和制備效率的同時，轉(zhuǎn)化時間越短越好。

3.2 展望：天然存在于何首烏中的二苯乙烯苷大多為反式結(jié)構(gòu)，順式含量僅有5.985%，本研究結(jié)果表明其在光照條件下可發(fā)生順反異構(gòu)而轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu)，今后應(yīng)對cis-THSG的生物活性、毒性等加以研究，以期更合理地評價光致異構(gòu)對二苯乙烯苷用藥有效性和安全性的影響。

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