曹貴彬 熊 昊* 游金明＊＊ 于會(huì)民韋啟鵬 鄒志恒 葉亞玲

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南昌 330045;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081;3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200)

磷是畜禽機(jī)體內(nèi)含量豐富的一種礦物元素，不僅參與畜禽骨骼、肌肉等組織的生成和生長(zhǎng)，還參與畜禽生命活動(dòng)的代謝過(guò)程。畜禽體內(nèi)的磷主要來(lái)源于飼料，而植物飼料中的磷主要以植酸磷及植酸鹽等形式存在，其中豆科、谷實(shí)等重要植物飼料中植酸磷含量更是占到了50%～75%。由于單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸磷和植酸鹽的植酸酶，因此飼料中的磷很大一部分難以被單胃動(dòng)物所利用。未被利用的磷隨糞尿排出體外，不僅造成磷源的浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染［1］。而為了滿足畜禽對(duì)磷的需要，向畜禽飼糧中添加一定比例的無(wú)機(jī)磷也增加了飼料成本。另外，畜禽機(jī)體對(duì)磷及其他其他礦物元素的吸收起協(xié)同作用，即畜禽對(duì)磷的吸收利用少也會(huì)影響到其他礦物元素的吸收利用，進(jìn)而影響畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育［2］。研究表明，植酸酶能直接作用于植酸磷和植酸鹽，釋放被螯合的礦物元素，從而促進(jìn)畜禽對(duì)鈣、磷、銅、鋅等礦物元素的吸收利用，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體肌肉、骨骼等組織的發(fā)育［3－5］。雖然目前大量研究報(bào)道了植酸酶可提高斷奶仔豬的鈣磷代謝，但鮮有從骨骼鈣磷含量及骨骼切片組織學(xué)角度闡述其作用的研究。本試驗(yàn)旨在以斷奶仔豬為研究對(duì)象，研究不同添加劑量耐熱植酸酶替代飼糧中無(wú)機(jī)磷對(duì)斷奶仔豬鈣磷代謝的影響，為仔豬飼糧中科學(xué)利用耐熱植酸酶及提高鈣磷利用率、減少鈣磷排放提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新型耐熱植酸酶(NHP)活性含量為5 000 U/g。該酶是從大腸桿菌來(lái)源普通植酸酶經(jīng)設(shè)計(jì)、突變、篩選及高效定向后獲得的陽(yáng)性突變體。普通植酸酶最適溫度為45℃，比活性為2 957 U/mg，熱穩(wěn)定性較差，60℃處理10 m in后剩余酶活為40%。在制粒溫度為80℃時(shí)，酶活性存余率僅為10%～30%。經(jīng)篩選后的新型耐熱植酸酶，最適pH5.0、同時(shí)具備耐80℃制粒高溫、常溫下高活性、抗蛋白酶降解等性能，比活性為4 000 U/mg。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組設(shè)計(jì)

選用遺傳背景相同、初始體重為(8.37±0.97)kg、30日齡斷奶的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交仔豬256頭，按照體重相近、性別比例一致的原則隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)16頭仔豬。

1.3 試驗(yàn)飼糧

4個(gè)處理仔豬分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(磷酸氫鈣添加量為 1.32%，有效磷含量為 0.37%，對(duì)照)、低磷飼糧(磷酸氫鈣添加量為0.72%，有效磷含量為0.24%，同時(shí)調(diào)整石粉和沸石粉添加量以保持飼糧鈣水平不變)、低磷飼糧基礎(chǔ)上添加0.01%新型耐熱植酸酶制劑(植酸酶添加量為500 U/kg)、低磷飼糧基礎(chǔ)上添加0.02%新型耐熱植酸酶制劑(植酸酶添加量為1 000 U/kg)。各飼糧在正常條件下制成顆粒飼料。參照美國(guó)NRC(2012)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際配制基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用地面平養(yǎng)，在封閉式仔豬舍內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)期內(nèi)提供適宜的溫濕度，自由采食和飲水。免疫消毒程序按豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行。飼養(yǎng)管理參照本品種豬的飼養(yǎng)規(guī)程執(zhí)行。試驗(yàn)期為30 d。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶(ALP)活性

于試驗(yàn)第30天，從每個(gè)重復(fù)選取3頭中等體重、健康狀況良好的仔豬空腹采血 5 m L，于3 000 r/m in離心10 m in，取血清，用于測(cè)定血清中鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性。

1.5.2 骨骼鈣磷沉積

于試驗(yàn)第30天，從每個(gè)重復(fù)中選取1頭中等體重、健康狀況良好的仔豬屠宰，取其右側(cè)后腿蹄骨，用手術(shù)刀小心剔除肌肉、筋脾及其他附著物，65℃烘干，放入乙醇∶苯混合液(混合比2∶1)中浸泡96 h脫脂，撈出，待乙醇:苯混合液揮發(fā)后，于105℃烘干至恒重，稱重，600℃馬福爐里灰化至恒重，稱重，計(jì)算灰分率，并測(cè)定灰分中鈣、磷含量。

1.5.3 趾骨組織學(xué)觀察

取屠宰仔豬右側(cè)后腿趾骨，用手術(shù)刀小心剔除肌肉、筋脾及其他附著物，置于10%甲醛中固定一段時(shí)間后，經(jīng)脫鈣、沖洗、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、染色及封片烘干之后，制成骨骼切片，于顯微鏡下對(duì)比觀察各處理之間仔豬趾骨骨密質(zhì)和骨松質(zhì)的差異。

1.5.4 養(yǎng)分表觀消化率

試驗(yàn)第28、29、30天，以重復(fù)為單位，用全收糞法收集糞便(200 g左右)，于105℃下烘干，回潮，稱重，粉碎，保存。通過(guò)測(cè)定飼糧和糞便中粗蛋白質(zhì)、能量、粗脂肪、鈣、磷及干物質(zhì)的含量來(lái)計(jì)算養(yǎng)分的表觀消化率。

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×(飼料中

某養(yǎng)分含量－糞中某養(yǎng)分含量)/

飼料中某養(yǎng)分含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

基本數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理，血清鈣、磷含量，血清堿性磷酸酶活性，骨骼鈣、磷沉積及養(yǎng)分表觀消化率結(jié)果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，差異顯著者用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響

新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響見(jiàn)表2。表中數(shù)據(jù)顯示，各處理仔豬血清中鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。基礎(chǔ)飼糧組(對(duì)照組)仔豬血清堿性磷酸酶活性最低，僅為354.23 U/L，低磷飼糧組、500 U/kg植酸酶添加組和1 000 U/kg植酸酶添加組分別比基礎(chǔ)飼糧組高9.08%、6.22%和 7.73%;與低磷飼糧組相比，植酸酶添加組和基礎(chǔ)飼糧組仔豬血清鈣、磷含量有提高趨勢(shì)。

表2 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響Table 2 Effects of NHP on Ca and P contents and ALP activity in serum of weaner piglets

2.2 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬骨骼鈣、磷沉積的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，各處理仔豬蹄骨的骨重、灰分重、灰分率、鈣和磷含量的變化差異均不顯著(P＞0.05)。但低磷飼糧組仔豬蹄骨的灰分重、灰分率、鈣和磷含量均最低，在低磷飼糧中添加500、1 000 U/kg新型耐熱植酸酶后以上指標(biāo)均有所改善，甚至略高于基礎(chǔ)飼糧組。相比于低磷飼糧組，對(duì)照組及2個(gè)植酸酶添加組仔豬蹄骨的灰分重分別提高了 12.12%、6.06%和 13.64%，灰分率分別提高了 6.66%、11.32%和 6.14%;2 個(gè)植酸酶添加組仔豬蹄骨鈣含量分別提高了3.97%和4.73%。

表3 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬蹄骨質(zhì)量的影響Table 3 Effects of NHP on coffin bone quality of weaner piglets

2.3 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬趾骨發(fā)育的組織學(xué)差異

由圖1可以看出，基礎(chǔ)飼糧組仔豬趾骨骨密質(zhì)菲薄，骨松質(zhì)內(nèi)骨小梁面積較大，但骨髓腔面積也較大，整體表現(xiàn)骨質(zhì)較為疏松;低磷飼糧組骨密質(zhì)菲薄，骨松質(zhì)內(nèi)骨小梁面積小，骨髓腔面積大，整體表現(xiàn)骨質(zhì)疏松;添加500、1 000 U/kg新型耐熱植酸酶后，仔豬趾骨骨密質(zhì)較厚，骨松質(zhì)內(nèi)骨小梁面積大，骨髓腔面積較小，整體表現(xiàn)為骨質(zhì)較為密集。

2.4 新型耐熱型植酸酶對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

新型耐熱型植酸酶對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響見(jiàn)表4。表中數(shù)據(jù)顯示，各處理仔豬粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率差異不顯著(P＞0.05)，但基礎(chǔ)飼糧組及2個(gè)植酸酶添加組仔豬的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率相對(duì)低磷飼糧組均有提高的趨勢(shì)。其中，500、1 000 U/kg植酸酶添加組的粗脂肪表觀消化率達(dá)到55.97%和55.90%，分別比低磷飼糧組提高6.98%和6.84%?；A(chǔ)飼糧組和500、1 000 U/kg植酸酶添加組的總能、鈣、磷及干物質(zhì)的表觀消化率均顯著高于低磷飼糧組(P＜0.05)，但 3 組之間差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶活性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，基礎(chǔ)飼糧組因添加有大量的無(wú)機(jī)磷，滿足了斷奶仔豬對(duì)鈣、磷的需求，而減弱了機(jī)體骨骼動(dòng)員釋放礦物元素的活動(dòng)，最終使血清中堿性磷酸酶活性低于低磷飼糧組和2個(gè)植酸酶添加組。另外，相比較植酸酶對(duì)骨骼中鈣、磷的沉積作用，植酸酶對(duì)血液中鈣、磷含量變化幾乎無(wú)影響。本試驗(yàn)結(jié)果與韓進(jìn)誠(chéng)等［6］用微生物植酸酶及周佳萍［7］用耐熱植酸酶對(duì)肉雞的試驗(yàn)結(jié)果吻合。

3.2 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬骨骼鈣、磷沉積的影響

自20世紀(jì)初植酸酶面世以來(lái)，便有大量研究證實(shí)植酸酶具有降解被植酸螯合的鈣、磷等礦物元素的作用，而一系列研究也發(fā)現(xiàn)，往畜禽飼糧中添加植酸酶能夠提高飼糧中鈣、磷、錳、鋅、銅及鐵等礦物元素的表觀消化率，并促進(jìn)畜禽對(duì)這些礦物元素在骨骼中的沉積，從而提高骨骼的灰分率［8－13］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，低磷飼糧中添加植酸酶對(duì)肉雞骨骼質(zhì)量并無(wú)影響［14］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，低磷飼糧中添加500、1 000 U/kg植酸酶，一定程度上促進(jìn)了斷奶仔豬對(duì)骨骼鈣磷的沉積，在骨骼的灰分重和灰分率上達(dá)到了與添加無(wú)機(jī)磷一樣的效果，但差異不顯著，這與Behnam等［15］的植酸酶對(duì)肉雞腳趾骨灰分試驗(yàn)的結(jié)果相似。出現(xiàn)這種情況可能與飼糧中高鈣和低磷有關(guān)，影響了植酸酶的效果，使之盡管一定程度上起到了促進(jìn)鈣磷及其他骨骼成分沉積的作用，但不足以大幅度提高骨骼對(duì)礦物元素的吸收。

圖1 斷奶仔豬趾骨組織結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Phalanges organizational structure of weaner piglets(100×)

表4 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 4 Effects of NHP on apparent digestibility of nutrients of weaner piglets %

3.3 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬趾骨發(fā)育的組織學(xué)觀察

骨骼主要是由礦物元素沉積而成型的，大體可以分為外層骨密質(zhì)和由海綿狀骨小梁支撐起的骨松質(zhì)2個(gè)部分。當(dāng)?shù)V物元素沉積不夠時(shí)，便容易出現(xiàn)骨密質(zhì)變薄，骨小梁變小，骨髓腔增大的現(xiàn)象，是造成動(dòng)物的骨折和骨質(zhì)疏松的重要因素。劉宗平等［16］對(duì)沙質(zhì)荒漠區(qū)的雙峰駝研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤、牧草中磷含量偏低，牧草鈣磷比值偏高時(shí)，雙峰駝容易出現(xiàn)消瘦、異嗜、運(yùn)動(dòng)障礙、骨質(zhì)疏松和容易骨折等病癥。另有在對(duì)兔子的試驗(yàn)中也得出鈣與兔應(yīng)力性骨折有一定相關(guān)性的結(jié)論［17］。Ma等［18］的研究指出，鋅能通過(guò)促進(jìn)骨膠原蛋白的合成來(lái)刺激骨骼的生長(zhǎng)。斷奶仔豬磷缺乏或代謝異常，是導(dǎo)致不能鈣化的肋骨膠原組織過(guò)度增生而形成佝僂病的主要原因。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)斷奶仔豬趾骨制成的骨骼切片進(jìn)行組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，添加500、1 000 U/kg新型耐熱植酸酶能增加骨密質(zhì)厚度，增大骨小梁面積，減小骨髓腔面積，最終達(dá)到增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度的作用，而基礎(chǔ)飼糧組及低磷飼糧組相比較植酸酶添加組就明顯顯現(xiàn)出骨質(zhì)較為疏松、骨密質(zhì)也較薄等情況，這與前面骨骼中灰分率及骨骼鈣、磷含量的變化一致。

3.4 新型耐熱植酸酶對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

大量的研究已證實(shí)，植酸酶能作用于植酸磷及植酸鹽，釋放被螯合的蛋白質(zhì)、淀粉、鈣、磷及一些消化酶，進(jìn)而提高機(jī)體對(duì)這些物質(zhì)的消化能力，從而提高這些物質(zhì)的表觀消化率和生物學(xué)效價(jià)［19－20］。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，植酸酶添加組在養(yǎng)分表觀消化率上基本達(dá)到甚至超過(guò)無(wú)機(jī)磷添加組，基本好于低磷飼糧組，與預(yù)期結(jié)果一致，也與許多關(guān)于植酸酶的研究［21－23］結(jié)果相似。但有試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶添加組的養(yǎng)分表觀消化率要好于甚至顯著高于無(wú)機(jī)磷添加組［24］。高俊杰等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加植酸酶不影響斷奶仔豬的粗蛋白質(zhì)表觀消化率。出現(xiàn)這種試驗(yàn)結(jié)果可能的原因是對(duì)照組添加有無(wú)機(jī)磷，改變了飼糧中的鈣磷比值，使其比值達(dá)到了適合畜禽生長(zhǎng)的1.2 ∶1［26］，促進(jìn)了斷奶仔豬機(jī)體內(nèi)的鈣磷平衡，促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)，而低磷飼糧組由于飼糧中磷的缺乏，加之植酸的作用，使仔豬體內(nèi)的鈣、磷比例失衡，不能有效合成為仔豬供能的三磷酸腺苷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能受阻，也影響仔豬體內(nèi)一些有效物質(zhì)的生物活性，最終導(dǎo)致其表觀消化率低于其他組。

4 結(jié)論

① 低磷飼糧中添加500、1 000 U/kg新型耐熱植酸酶在一定程度上促進(jìn)了斷奶仔豬對(duì)骨骼中鈣、磷的沉積，并有效提高了斷奶仔豬養(yǎng)分的表觀消化率，但對(duì)血液中鈣、磷代謝影響不大。

② 仔豬飼糧中添加500、1 000 U/kg新型耐熱植酸酶能替代部分無(wú)機(jī)磷，起到與基礎(chǔ)飼糧相同甚至更好的作用，其中1 000 U/kg添加量稍好，但與500 U/kg添加量差別不大。

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