齊景凱，孫福祥

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028043；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)分析測(cè)試中心，內(nèi)蒙古通遼028043）

牛骨肉味香精抗氧化性的研究

齊景凱1，孫福祥2

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028043；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)分析測(cè)試中心，內(nèi)蒙古通遼028043）

以牛骨肉味香精為研究對(duì)象，以Trolox和VC為對(duì)照，探討了牛骨肉味香精的抗氧性及影響抗氧化性的因素。結(jié)果顯示：牛骨肉味香精在ABTS體系、Fenton體系、DPPH體系和NBT體系中均具有抗氧化性，牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力受pH、時(shí)間和溫度的影響。同時(shí)在pH=5、2 h、100℃下牛骨肉味香精在ABTS體系中的抗氧化能力最強(qiáng)。

牛骨肉味香精；抗氧化性；影響因素

自由基是生物體氧化過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，機(jī)體在產(chǎn)生自由基的同時(shí)也在及時(shí)的清除自由基。當(dāng)機(jī)體清除自由基能力下降或體內(nèi)自由基生成過(guò)多時(shí)，過(guò)剩的自由基在體內(nèi)堆積，作用于生物膜多不飽和脂肪酸，使之發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而引起膜結(jié)構(gòu)和功能紊亂。適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充抗氧化食品，可清除自由基，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。近年來(lái)關(guān)于肉味香精清除自由基性質(zhì)的研究多集中于豬肉、牛肉、雞肉等[1-2]。在國(guó)內(nèi)，來(lái)源于動(dòng)物骨骼的肉味香精的抗氧化性研究甚少，更少見報(bào)道影響肉味香精抗氧化性的因素。因此，本文對(duì)牛骨膠肉味香精清除自由基ABTS+·、DPPH·、O2-·和·OH的活性及其抗氧化性進(jìn)行了研究，并討論了在ABTS體系中影響抗氧化性的因素，以期為牛骨的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨肉味香精（實(shí)驗(yàn)室自制）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（S0119-1 ABTS）和DPPH（1，1-二苯-2-苦基肼）均購(gòu)于Sigma公司，6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（水溶性Trolox）、核黃素（VB）、蛋氨酸（Met）、乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS（磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液）、四氮唑藍(lán)（NBT）（Fluka公司）、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、95％乙醇、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、二次亞沸蒸餾水、VC。

1.2 儀器與設(shè)備

754型分光光度計(jì)：上海產(chǎn)第三分析儀器廠；557型分光光度計(jì)：日立；GL20G-H型-高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA1004型電子天平：上海精密天平儀器有限公司；THZ-82型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器：江蘇金壇市榮華儀器有限公司；PHS-3C實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式pH計(jì)：上海雷磁儀廠；HH-4恒溫水浴鍋：深圳天南海北有限公司；9240型電熱恒溫干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 香精在ABTS體系中抗氧化性的測(cè)定—總抗氧化能力檢測(cè)[3-4]

采用ABTS檢測(cè)試劑盒法，具體操作參照S0119-1 ABTS檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，以Trolox和抗壞血酸作為對(duì)照品。

1.3.2 香精在Fenton反應(yīng)體系中抗氧化性的測(cè)定—清除羥自由基能力的測(cè)定[5]

在反應(yīng)體系中加入9mmol/LFeSO4和9mmol/L的水楊酸一乙醇溶液各10mL，然后加入一定濃度的肉味香精溶液10mL，最后加入10mL 8.8mmol/LH2O2啟動(dòng)反應(yīng)。對(duì)照液中加入10mL蒸餾水替換同體積的水解液，37℃條件下保溫0.5 h，以蒸餾水為參比液，在510 nm測(cè)定吸光值。清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0為肉味香精的本底吸光度。

另以不同濃度的Trolox和VC清除·OH的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算牛骨肉味香精Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）和AEAC（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity）。

1.3.3 香精在DPPH體系中抗氧化性的測(cè)定—清除DPPH·能力的測(cè)定[6]

具塞試管中加入2mL 2×10-4mol/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液，加入2mL各濃度梯度肉味香精的無(wú)水乙醇溶液，混勻，對(duì)照液中加入2mL無(wú)水乙醇替換同體積各濃度梯度的肉味香精，室溫放置30min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0為肉味香精的本底吸光度。

另以不同濃度的Trolox和VC清除DPPH·自的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算牛骨肉味香精的Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.3.4 香精在NBT體系中抗氧化性的測(cè)定—清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定[7]

以0.05mol/L的混合磷酸鹽緩沖液（p H=7.4）為溶劑，配制0.1mmol/L的VC、0.01mmol/L的Met和4.6×10-5mol/L的NBT溶液，加入不同濃度的肉味香精溶液，反應(yīng)液總體積為3.8mL，距離3 5 cm，3 0W日光燈下照射一定時(shí)間后，立即用UV-754型分光光度計(jì)在560 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度值（A），以緩沖溶液為參比。清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0為肉味香精的本底吸光度。

另以不同濃度的Trolox和VC清除O2-·的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算牛骨肉味香精的Trolox和VC當(dāng)量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.3.5 影響香精在ABTS體系中抗氧化能力的因素

1.3.5.1 pH對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

用緩沖液調(diào)節(jié)牛骨肉味香精溶液pH為2、3、4、5、6、7、8，在25℃下，采用ABTS試劑盒法，測(cè)定在不同pH下的TEAC值。

1.3.5.2 時(shí)間t對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

用緩沖液調(diào)節(jié)牛骨肉味香精溶液pH=7，在25℃下，采用ABTS試劑盒法，測(cè)定牛骨肉味香精在t=30、60、90、120、150、180、210min下的TEAC值。

1.3.5.3 溫度對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

用緩沖液調(diào)節(jié)牛骨肉味香精溶液pH=7，采用ABTS試劑盒法，在t=120min下，測(cè)定牛骨肉味香精在T=25、50、75、100、125、150℃下的TEAC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總抗氧化能力的測(cè)定

ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+·，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+·的產(chǎn)生會(huì)被抑制，在734 nm測(cè)定ABTS+·的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，樣品的抗氧化能力見表1。

表1 牛骨肉味香精的ABTS+·清除能力（x±s）Table1 ABTS+·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

從表1可以看出與兩種常用人工抗氧化劑Trolox和VC相比，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50雖然較低，分別為1.108、0.258mmol/g和1.083mg/mL，但對(duì)ABTS+·仍有一定的清除作用。

2.2 羥自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

水楊酸可以捕獲羥自由基，生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，在波長(zhǎng)510 nm處有最大吸收的原理，用分光光度法檢測(cè)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基，加入抗氧化劑后，抑制羥自由基的生成，吸光值改變，本實(shí)驗(yàn)以常用的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸作為對(duì)照，樣品的羥自由基清除能力見表2。

表2 牛骨肉味香精的·OH清除能力（x±s）Table2·OH radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

從表2可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分別為0.917、0.185mmol/g和6.651mg/mL，雖然低于人工合成的常用抗氧化劑，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.3 DPPH·自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

DPPH·的甲醇溶液呈深紫色，可見光區(qū)最大吸收峰為517 nm。當(dāng)自由基清除劑加入到DPPH·溶液中時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)而使其顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度減少，而且顏色變淺的程度與配電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因此，可通過(guò)吸光度減弱的程度來(lái)評(píng)價(jià)自由基被消除的情況。本實(shí)驗(yàn)以常用的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸作為對(duì)照，樣品的DPPH·自由基清除能力見表3。

表3 牛骨肉味香精的DPPH·清除能力（x±s）Table3 DPPH·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

從表3可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分別為1.721mmol/g、0.258mmol/g和1.334mg/mL，雖然低于人工合成的常用抗氧化劑，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.4 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

蛋氨酸作用于核黃素時(shí)可產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子在照光后可將NBT還原而生成藍(lán)色甲腙，藍(lán)色甲腙在560 nm處有最大光吸收?？寡趸锬芤种芅BT的光化還原，其抑制強(qiáng)度與濃度在一定范圍內(nèi)成正比，本實(shí)驗(yàn)以常用的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸作為對(duì)照，樣品的超氧陰離子自由基清除能力見表4。

表4 牛骨肉味香精的O2-·清除能力（x±s）Table4 O2-·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

從表4可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分別為2.362mmol/g、0.569mmol/g和3.716mg/mL，雖然低于人工合成的常用抗氧化劑，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.5 影響牛骨香精在ABTS體系中抗氧化能力的因素

2.5.1 pH對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

酸堿度是影響物質(zhì)抗氧化活性正常發(fā)揮作用的重要因素之一。在不同的pH條件下，體系所提供的ABTS+·數(shù)量有很大區(qū)別，其TEAC值也不相同，結(jié)果見表5。

表5 pH對(duì)牛骨肉味香精抗氧化能力的影響Table5 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from pH

從表5中可以看出，隨著pH的升高，TEAC值逐漸增大，抗氧化性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH=5時(shí)，TEAC值達(dá)最大，抗氧化性最強(qiáng)，之后TEAC值又逐漸降低，抗氧化性下降。

2.5.2 時(shí)間對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

抗氧化物質(zhì)對(duì)自由基的作用類型有快速反應(yīng)型和慢速反應(yīng)型。因此，向ABTS+·溶液中加入抗氧化物質(zhì)到測(cè)定該體系吸光度所用的顯色時(shí)間長(zhǎng)短，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，時(shí)間對(duì)抗氧化能力的影響見表6。

從表6中可知隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肉味香精的TEAC值變化趨勢(shì)平緩，反應(yīng)120min后穩(wěn)定，達(dá)最大，之后又逐漸下降。

表6 時(shí)間對(duì)牛骨肉味香精抗氧化能力的影響Table6 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from time

2.5.2 溫度對(duì)牛骨肉味香精在ABTS體系中抗氧化能力的影響

溫度對(duì)抗氧化能力的影響結(jié)果見表7。

表7 溫度對(duì)牛骨肉味香精抗氧化能力的影響Table7 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from temperature

從表7中可知，隨著溫度的升高，肉味香精的TEAC值逐漸增大，反應(yīng)100℃達(dá)最大，之后又逐漸下降?？偟膩?lái)說(shuō)，肉味香精的耐熱性很強(qiáng)。

3 結(jié)論

1）牛骨肉味香精對(duì)四種自由基均有清除作用。對(duì)自由基ABTS+·的TEAC、AEAC和IC50值分別為1.108mmol/g、0.258mmol/g和1.083mg/mL；對(duì)自由基DPPH·的TEAC、AEAC和IC50分別為1.721 mmol/g、0.258mmol/g和1.334mg/mL；對(duì)自由基O2-·的TEAC、AEAC和IC50分別為2.362 mmol/g、0.569 mmol/g和3.716mg/mL；對(duì)自由基·OH的TEAC、AEAC和IC50分別為0.917mmol/g、0.185mmol/g和6.651mg/mL?？梢娫谧钄嘧杂苫磻?yīng)的途徑中，牛骨肉味香精具有顯著的抗氧化活性。

2）牛骨肉味香精的抗氧化能力受環(huán)境因素的影響，在pH=5、2 h、100℃下牛骨肉味香精在ABTS體系中的抗氧化能力最強(qiáng)。

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Study on Antioxidation and Influence Factors of Cow Bone Meat Flavoring

QI Jing-kai1，SUN Fu-xiang2
（1.Life Technological College of Inner Mongolia University of Nationalities，Tongliao 028043，Inner Mongolia，China；2.Analysis Center of Inner Mongolia University of Nationalities，Tongliao028043，Inner Mongolia，China）

The antioxidant activities of the cow bone meat flavoring were studied in NBT，DPPH，ABTS and Fenton reaction systems.The results showed that the cow bone meat flavoring showed antioxidant effects in ABTS，F(xiàn)enton reaction systems，DPPH，and NBT.pH，time and temperature had an effect on ability of antioxidant of cow bone meat flavoring in ABTS reaction systems.Cow bone meat flavoring had the most antioxidant ability in ABTS reaction systems under the condition of pH 5，2hand 100℃.

cow bone meat flavoring；antioxidant reaction；influence factors

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.036

2012-09-14

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2010MS0403）

齊景凱（1972—），男（蒙古），講師，碩士研究生，從事畜產(chǎn)品開發(fā)利用研究工作。