陸文蔚，黃玥

（上海商學(xué)院食品系，上海200234）

黑花生衣中黃酮類物質(zhì)的提取方法研究

陸文蔚，黃玥

（上海商學(xué)院食品系，上海200234）

研究超聲波輔助提取黑花生衣中黃酮類化合物的工藝條件，探討乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、pH對(duì)提取效果的影響。確定影響黃酮提取效果的最主要因素是料液比，并得出黑花生衣中黃酮類化合物在超聲波頻率為50 kHz條件下提取的最佳工藝條件為：提取溶劑為60％乙醇，提取時(shí)間45min，提取溫度40℃，料液比1∶300（g/mL），pH2.5。在此基礎(chǔ)上，通過測(cè)定黑花生衣提取液對(duì)活性自由基的清除作用，探討其抗氧化活性。結(jié)果表明，黑花生衣中黃酮類化合物對(duì)羥基自由基（·OH）、和DPPH·自由基皆具有顯著的清除作用，且其清除作用與濃度之間呈量效關(guān)系。

黑花生衣；黃酮類化合物；超聲波；抗氧化

黑花生衣色素是從黑花生內(nèi)衣提取的一類色素，花生衣色素主要成分為黃酮類化合物，含有花色苷、黃酮、二氫黃酮等。研究發(fā)現(xiàn)，黑花生與普通的紅衣花生相比，前者種衣中含有較高含量的花色苷，且其色澤深，容易提取，因此，黑花生衣色素在保健食品及醫(yī)療食品等方面具有廣闊的開發(fā)前景[1-3]。國(guó)外對(duì)黑花生衣的研究非常少，對(duì)類似的黃酮類化合物等的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)作用的分子機(jī)理，因此在黑花生衣中黃酮類化合物的許多方面還缺乏研究數(shù)據(jù)[4-7]。

乙醇對(duì)于極性大的花色苷色素的提取是優(yōu)良的提取溶劑[3]。超聲波具有減少溶劑耗量、縮短萃取時(shí)間的特點(diǎn)，并且在不破壞有效成分和較低的溫度下就能實(shí)現(xiàn)高效率的提取。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)黑花生衣中黃酮類化合物在超聲波條件下進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，并初步研究其抗氧化活性，為黑花生衣色素的研究及利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑花生（市售）；硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、無水乙醇、蒸餾水、Tris-HCl溶液、鹽酸、沒食子酸、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、DPPH、蘆?。海▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），均為分析純。

756CRT紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海魯伊工貿(mào)有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 黑花生衣色素黃酮類化合物的提取流程

黑花生仁→真空干燥→剝?nèi)』ㄉ隆鬯椋ㄟ^40目篩）→乙醇溶液浸提→離心（4 000 r/min）→取上清液→備用

1.2.2 提取條件的確定

1.2.2.1 單因素對(duì)提取效果的影響

提取條件的研究主要考慮以下5個(gè)因素：乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、pH。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)確定最佳提取條件

鑒于乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、pH對(duì)黑花生衣色素中黃酮的提取均有一定的影響，通過L18（37）正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，試驗(yàn)水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素水平Table1 The levels of orthogonal test

1.2.3 蘆丁法測(cè)定測(cè)定黑花生衣中總黃酮的含量

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁55.45mg，以60％的乙醇定容至50mL，取10mL以30％的乙醇定容至50mL，作為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液備用；稱取2.5 gNaNO2，以去離子水定容至50 mL，作為5％NaNO2溶液備用。稱取5.0 g Al（NO3）3，以去離子水定容至50mL，作為10％Al（NO3）3溶液備用。

分別吸取上述配置好的蘆丁母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于具塞試管中，以30％乙醇定容至10mL，加入5％NaNO2溶液1.0mL，搖勻靜置60min，然后加入10％Al（NO3）3溶液1.0mL，以去離子水定容至25mL，混合均勻，靜置15min，在510 nm下測(cè)定吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

稱取樣品粉碎的黑花生衣0.019 4 g，以30％乙醇定容至10mL，按照制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的含量。

1.2.4 黑花生衣黃酮類化合物抗氧化能力的測(cè)定

1.2.4.1 清除羥自由基能力的測(cè)定

Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基能與水楊酸生成羥基化產(chǎn)物2，3-二羥基苯甲酸，用比色法測(cè)定其含量能間接測(cè)定羥自由基的生成量。

準(zhǔn)確稱取1.0 g經(jīng)粉碎的黑花生衣，在最佳提取條件下進(jìn)行提取，離心，取上清液。按照比例配置成濃度梯度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的黑花生衣提取液。依次向各試管中加入上述各提取液1.00 mL，F(xiàn)eSO4溶液（1.8mmol/mL）2.00mL，水楊酸–乙醇（1.8mmol/mL）1.50mL，最后加H2O2（體積分?jǐn)?shù)為0.03％）0.10mL啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩試管，混合溶液，水浴37℃，保溫30min，然后在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)量各濃度的吸光度值A(chǔ)s。同時(shí)在相同條件下做空白試驗(yàn)，所測(cè)得吸光值記為A0。根據(jù)公式D=[（A0-AS）/A0]×100％計(jì)算清除能力，并繪制清除率（D）與樣品濃度曲線[9-10]。

1.2.4.2 清除DPPH自由基效能力的測(cè)定

同1.2.4.1，將提取液配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL濃度溶液，分別吸取樣液2.0mL，加入DPPH·乙醇溶液（2.0mg/mL）2.0mL，振蕩混均，25℃水浴30min，以無水乙醇為對(duì)照，520 nm處測(cè)定試液的吸光度A1。同時(shí)，取2.0mL待測(cè)樣液與2.0mL無水乙醇進(jìn)行混合，以無水乙醇為對(duì)照，在520 nm處測(cè)定試液的吸光度A2。將2.0mLDPPH·乙醇溶液與2.0mL無水乙醇混合，同樣以無水乙醇為對(duì)照，于520 nm處測(cè)定試液的吸光度A3。每組測(cè)定3次，求取平均值。根據(jù)公式D=[1-（A1-A2）/A3]×100計(jì)算樣品的清除能力，并繪制清除率（D）與樣品濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑花生衣提取液最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

通過掃描，黑花生衣提取液在520 nm處有最大吸收，屬于黃酮類化合物的特征吸收峰，見圖1。

圖1 最大吸收峰的掃描圖譜Fig.1 The curve of wavelength-absorbance

研究表明花色苷的最大吸收區(qū)在500 nm～550 nm，由此可以推測(cè)，在黑花生衣黃酮類化合物中，花色苷是主要成分之一。此后試驗(yàn)中以520 nm處的吸光度值來衡量提取效果的差異。

2.2 單因素對(duì)提取效果的影響

2.2.1 不同乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

乙醇水溶液提取過程中控制體系的提取溫度50℃、料液比1∶500（g/mL）、提取時(shí)間1h、pH為2.0，提取次數(shù)1次。設(shè)置20％、40％、60％、80％、100％（體積百分比）的乙醇溶液對(duì)黑花生衣粉末進(jìn)行提取，研究不同乙醇濃度對(duì)黑花生衣色素提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響（520 nm）Fig.2 Effect of concentration on extraction（520 nm）

由圖2可知，在乙醇濃度20％～60％的范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高，吸光度也隨著增加。在此之后，隨著乙醇濃度的升高，吸光度隨之減小，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80％時(shí)，吸光值變小且趨于平穩(wěn)。

2.2.2 料液比對(duì)提取效果的影響

提取過程中控制體系的提取溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、提取時(shí)間1 h、pH2.0、提取次數(shù)1次。研究不同提取料液比對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)提取效率的影響（520 nm）Fig.3 Effect of material ratio and solvent on extraction（520 nm）

隨著料液比的增大，吸光度的變化量也在逐漸減少，在料液比為1∶500（g/mL）以后，吸光度的變化量基本趨于穩(wěn)定，無明顯的變化，為得到較大提取率，并且節(jié)約成本，選取1∶300（g/mL）比較合適。

2.2.3 溫度對(duì)提取效果的影響

提取過程中控制體系的乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、提取時(shí)間1 h、料液比為1∶500（g/mL）、pH為2.0提取次數(shù)1次?？疾椴煌瑴囟葘?duì)黑花生衣色素提取率的影響，見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)提取效果的影響（520 nm）Fig.4 Effect of temperature on extraction（520 nm）

從30℃～50℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，吸光值逐漸減小，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，吸光度上升。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，則吸光度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能與花色苷熱不穩(wěn)定發(fā)生降解有關(guān)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

提取過程中控制體系的乙醇濃度為60％、提取溫度50℃、料液比1∶500（g/mL）、pH為2.0、提取次數(shù)為1次，研究不同提取時(shí)間對(duì)黑花生衣色素提取率的影響，見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響（520 nm）Fig.5 Effect of time on extraction（520 nm）

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的增加，吸光度增大，在提取時(shí)間45min時(shí)達(dá)到最高，以后又趨于下降。這表明，提取時(shí)間與色素變化密切相關(guān)，時(shí)間過短，可能提取還不夠充分，所以吸光度不大；但時(shí)間過長(zhǎng)，又可能引起花色苷等化合物結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使吸光度降低。

2.2.5 pH對(duì)提取效果的影響

提取過程中控制體系的乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、提取時(shí)間1 h、料液比為1∶500（g/mL）、溫度50℃，提取次數(shù)1次，研究不同pH對(duì)黑花生衣色素提取率的影響，見圖6。

圖6 pH對(duì)黑花生衣色素提取率的影響（520 nm）Fig.6 Effect of pH on extraction（520 nm）

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The results orthogonal test

由圖6可知，pH在較小的值時(shí)吸光度比較大。pH越小，提取越充分，提取率越高。pH降低到1.5時(shí)，吸光度開始下降，可能與花色苷在強(qiáng)酸條件下不穩(wěn)定有關(guān)。

2.3 最佳提取工藝的確定

按表1所示的試驗(yàn)水平進(jìn)行L18（37）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，影響黑花生衣黃酮提取效果的因素的主次順序?yàn)锽＞A＞D＞E＞C，即料液比＞乙醇濃度＞浸提溫度＞pH＞提取時(shí)間。其最優(yōu)組合是A2B1C1D1E2。

做驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得由該組條件所得的提取液的吸光度值為0.712，符合上述結(jié)論。因此可確定在頻率為50 kHz的超聲波提取條件下，黑花生衣黃酮類化合物的最佳提取工藝條件：乙醇濃度60％，料液比1∶300（g/mL），提取時(shí)間45min，提取溫度40℃，pH為2.5。

2.4 黑花生衣中總黃酮的含量

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7，黑花生衣提取液中總黃酮的含量為74.7mg/g。

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線Fig.7 Working curve of rutin

2.5 黑花生衣黃酮類化合物清除羥自由基的效果

黑花生衣黃酮類提取液對(duì)羥自由基的清除效果見圖8。

圖8 黑花生衣提取液清除羥自由基的效果Fig.8 Elimination of extraction on·OH

由圖8可知，黑花生衣提取液對(duì)于羥自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。計(jì)算可知，IC50為0.18mg/mL。

2.6 黑花生衣黃酮類化合物清除DPPH自由基的效果

黑花生衣黃酮類提取液對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖9。

圖9 黑花生衣提取液清除羥自由基的效果Fig.9 Elimination of extraction on·OH

由圖9可知，黑花生衣提取液對(duì)于DPPH自由基的清除效果均隨著濃度的增大而增強(qiáng)。計(jì)算可知IC50為0.035mg/mL。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑花生衣黃酮類化合物具有較強(qiáng)的清除自由基的功能，據(jù)相關(guān)研究表明黑花生衣色素中黃酮類化合物是自然界中最大的一類水溶性天然色素[8]，特別是花色苷具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、降低低密度脂蛋白等多重功能。在本文基礎(chǔ)上，研究將進(jìn)一步探討黃酮類化合物中花色苷等組分的分離、提取純化條件，進(jìn)一步掌握抗氧化功能因子的含量及組成。

黑花生衣色素是一種具有抗氧化活性的天然色素，不僅可用于食品的著色，而且可以起到保健作用[11]，對(duì)其研究具有現(xiàn)實(shí)意義。本文采用超聲波輔助提取，乙醇水溶液作為提取劑可以最大程度保持黃酮類化合物的活性，提高提取效率，并且降低成本。該方法操作容易，而且也易于工業(yè)化。不僅能夠得到較多的黃酮類化合物，也為黑花生進(jìn)行保健食品開發(fā)、功能因子提取等研究提供方法和參考。

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Study on Extraction of Flavonoid Com pounds from Blank Peanut Skin Pigment

LU Wen-wei，HUANG Yue
（The Department of Food Science，Shanghai Business School，Shanghai200234，China）

Ultrasound-assisted extraction of flavonoid compounds from black peanut skin was studied in this paper，and we discussed the effect of the solvent concentration，extraction time，extraction temperature，ratio of solid and liquid and pH．The results showed that the most important factor was the ratio of solid and liquid．The optimum conditionswere determined as：ultrasonic（50 kHz），60％ethanol，extraction time 45min，extraction temperature40℃，the ratio of solid and liquid 1∶300（g/mL）and pH 2.5．This paper also studied on the scavenging activity of the flavonoid compounds on the free radicals．The result showed that the flavonoid compounds can remove hydroxyl radicals and DPPH·，and the antioxidative activities increased with the increasing of the concentration．

Black peanut skin；flavonoid compounds；ultrasonic；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.011

2013-12-05

上海商學(xué)院重點(diǎn)課程建設(shè)項(xiàng)目；上海商學(xué)院科研項(xiàng)目（A-0201-00-050-105）

陸文蔚（1979—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品分析檢測(cè)教學(xué)與科研工作。