王玲慧等

摘 要：采集楊凌五泉、揉谷和李臺3個番茄主產區(qū)表現矮化、黃化及曲葉癥狀的植株嫩葉，克隆番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）基因全長并測序，依次得到病毒分離物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通過多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構建及蛋白質結構和理化性質預測等生物信息學方法進行基因組和蛋白質的特征分析，結果表明，楊凌區(qū)3個TYLCV分離物之間全長核苷酸相似度為99.3%～99.4%，是不伴隨衛(wèi)星分子的單組分病毒，屬TYLCV-IS株系的不同分離物，全長為2 781 nt；與山東壽光病毒分離物TYLCV-SDSG親緣關系最近，相似度為99.6%，與陜西涇陽的分離物TYLCV-SX8相似度為99.1%，與以色列株系TYLCV-IS相似度達97.7%～97.8%；編碼6個蛋白質，其中CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、TrAP、C4為胞內蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

關鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；楊凌；番茄；生物信息學分析

中圖分類號：S436.412.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2014）04-0054-07

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上最重要的蔬菜作物之一[1]，而番茄黃化曲葉?。═omato

yellow leaf curl disease，TYLCD）為全球番茄生產中最具威脅的“植物癌癥”[2]，1961年以色列最先鑒定的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是其主要病原。TYLCV為單鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于雙生病毒科（Geminiviridea）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），由煙粉虱（Bemisia tabaci）以持久性方式傳播[3，4]，在寄主細胞核內形成的雙鏈DNA復制中間體共編碼6個開放閱讀框。楊凌區(qū)是我國唯一的農業(yè)高新技術產業(yè)示范區(qū)，位于陜西省關中平原中部，2011年楊凌暴發(fā)的TYLCD已成為限制楊凌區(qū)番茄生產的主要因素，但目前未見有楊凌TYLCV全基因組分子特征及編碼蛋白生物信息學分析的研究報道。本試驗對楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產區(qū)進行調查采樣，對病毒分離物進行全長克隆、測序和變異分析，并對病毒編碼蛋白質的氨基酸序列和蛋白質跨膜結構、不穩(wěn)定系數等性質進行了比較分析，旨在進一步明確陜西楊凌番茄黃化曲葉病毒基因組結構和進化起源，為進一步開展番茄黃化曲葉病的防控工作、番茄分子抗病育種、病毒變異進化和病毒編碼蛋白質結構功能研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

①毒源樣品 在陜西省楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產區(qū)采集表現生長遲滯矮化、上部葉片黃化、葉片邊緣向上卷曲、褶皺簇狀、后期不能正常開花結果癥狀的番茄植株嫩葉各1份，常溫下用采樣袋密封帶回，液氮速凍后置于-80℃保存。

②試劑 Pfu DNA Polymerase購自Fermenents公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）購自Bioteke公司，質粒微量提取試劑盒購自BIOMIGA公司，PrimeSTAR Max DNA Polymerase、加A尾試劑盒A-Tailing Kit、克隆載體PMD18-T和DH5α感受態(tài)大腸桿菌購自TaKaRa公司，試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

①植物總DNA的提取和病毒分子鑒定 DNA的提取用CTAB法，得到的樣品DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。TYLCV鑒定用李常保等[5]設計的TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R；陽性對照TYLCV-SH2由浙江大學周雪平教授饋贈。DNA-B組分鑒定用雙生病毒DNA-B組分鑒定通用引物PCRc1/PBLv2040[6]；衛(wèi)星DNA β鑒定用雙生病毒衛(wèi)星DNA β鑒定通用引物Beta01/Beta02[7]，引物序列和目標條帶大小見表1。

②分子克隆和測序 用TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R，Pfu DNA Polymerase擴增部分片段（約500 bp）后回收，用A-tailing Kit加A尾后克隆至PMD18-T載體，轉化入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經氨芐抗性篩選、菌液PCR鑒定及提取質粒酶切驗證后用于測序。依據測得的519 bp序列用Primer Premier軟件（Version 5.0，Premier，Canada）設計相鄰背向引物SX-F/SX-R，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase擴增病毒基因組全長，經克隆并測序得到基因組全序列。

③序列比對分析和進化樹的構建 通過NCBI Blast（Basic local alignment search tool）尋找TYLCV同源序列信息。用DNAStar Package的MEGA （Version 5.05，Madison，Wis，USA）軟件[8]中的

MUSCLE算法進行多序列比對分析后，用鄰近相連法（Neighbor-joining）構建基于病毒DNA-A核苷酸全序列的系統(tǒng)進化樹。用DNAMAN（Version 5.2.2，Lynnon Biosoft，Quebec Canada）軟件構建不同TYLCV分離物的同源矩陣。

④病毒基因組結構分析 病毒開放閱讀框的查找利用NCBI的ORF Finder （Open Reading Frame Finder，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）在線工具。病毒基因組結構圖利用DNAStar Package中的SeqBuilder軟件繪制。

⑤蛋白質跨膜結構和理化性質的預測及分析 病毒蛋白質的跨膜結構利用TMpred （http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）在線工具預測。蛋白質理化性質利用ExPASy的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線工具進行分析。

2 結果與分析

2.1 采集樣品DNA病毒全長克隆和聚類分析

①TYLCV病毒分子鑒定 通過用TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R對樣品DNA進行PCR鑒定，結果顯示，3個樣品TYLCV-SXYL2、SXYL3和SXYL4都為帶毒植株（圖1），并克隆測序得到519 bp序列。以雙生病毒DNA-B組分通用引物PCRc1/PBLv2040進行PCR擴增，未得到預期500～650 bp大小的條帶，以雙生病毒衛(wèi)星DNA β鑒定通用引物Beta01/Beta02進行PCR反應，也未得到預期1 200～1 400 bp大小的條帶。結果表明，陜西楊凌地區(qū)侵染番茄的TYLCV為不含DNA-B且不伴隨衛(wèi)星DNA β的單組分病毒，只含DNA-A。

②DNA-A全長的同源矩陣 選擇NCBI登錄的國內外不同地區(qū)分離的19個TYLCV分離物（表2），用DNAMAN多序列比對后構建同源矩陣（表3）。發(fā)現楊凌區(qū)3個分離物TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4核苷酸序列全長之間相似度為99.3%～99.4%，且和TYLCV-IS相似度為97.7%～97.8%。楊凌區(qū)的3個病毒分離物與山東壽光分離物TYLCV-SDSG的相似度都為99.6%，與陜西涇陽的分離物TYLCV-SX8的相似度都為99.1%。

③基于DNA-A全長的系統(tǒng)進化樹 陜西楊凌3個TYLCV分離物同19個不同國家地區(qū)的TYLCV通過MEGA5.05軟件中MUSCLE算法多序列比對后，用鄰近相連（Neighbor-Joining）法構建系統(tǒng)進化樹（圖2）發(fā)現，楊凌分離物和山東壽光分離物TYLCV-SDSG、河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1、陜西涇陽分離物TYLCV-SX8、安徽分離物TYLCV-AH1、北京分離物TYLCV-Beijing3、美國分離物TYLCV-USA及浙江分離物TYLCV-ZJ8在同一小支上，且與山東壽光分離物TYLCV-SDSG親緣關系最近。上述分離物還與上海分離物TYLCV-SH2[9]、日本分離物TYLCV-Janpan、荷蘭分離物TYLCV-Netherlands和以色列株系TYLCV-IS在同一大支上。意大利撒丁島分離物TYLCSV和西班牙馬加拉分離物TYLCMalV在同一支。廣東分離物TYLCGV-G3和越南分離物TYLCVNV在同一支。新疆分離物TYLCV-XJ26-4和廣西分離物中國番茄黃化曲葉病毒TYLCCNV為同一支。云南分離物TYLTHV-Y72和泰國分離物TYLCTHV在同一支。由此可知，我國番茄黃化曲葉病毒的分布和種類同樣有較大的復雜性和多樣性，而楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物很可能由最早發(fā)現的TYLCV-IS發(fā)展而來，且與山東壽光分離物親緣關系最近，基于楊凌地區(qū)與山東壽光種苗交易頻繁的現狀，推測很可能是因為感病幼苗交易帶來了病毒傳播與蔓延。

2.2 病毒DNA-A全長序列和基因組結構

設計背向引物PCR擴增并克隆得到病毒DNA-A全長。測序結果表明，TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4（GenBank登錄號依次為KC138545、KC138544、KC138543）全長都為2 781 nt，共編碼6個開放閱讀框（圖3），在病毒鏈上編碼外殼蛋白和AV2蛋白，在互補鏈上編碼復制相關蛋白、轉錄激活子、復制增強子和AC4蛋白。在AC1和AV2之間有313 nt的非編碼區(qū)，也叫基因間隔區(qū)。

①基因間隔區(qū) 基因間隔區(qū)（Intergenic Region，IR）位于1～147 nt和2 616～2 781 nt，共含313個核苷酸，有調控病毒復制和轉錄起始必須的元件，含有病毒復制和轉錄所必需的結構域以及莖環(huán)結構，莖環(huán)頂端有保守的九核苷酸TAATATT/AC序列。由于IR區(qū)相對于編碼區(qū)選擇壓小，也是病毒變異最活躍的區(qū)域。通過對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4 和 TYLCV-IS的IR區(qū)核苷酸序列比較（圖4）發(fā)現，其特征序列中莖環(huán)頂端的九核苷酸TAATATT/AC（位于2 775～2 781 nt及1～2 nt）保守序列、TATA box和TATATA box，與TYLCV-IS一致，但CAAT box和5～8 nt短重復序列已表現出與TYLCV-IS有較大差異，其中短重復序列是Rep蛋白的結合位點。

②編碼蛋白的結構和性質分析 為進一步了解楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物編碼蛋白質氨基酸序列的變異特點和更好地進行蛋白質性質分析，將TYLCV-SXYL4與19個其他地區(qū)分離物及TYLCV-SXYL2、SXYL3編碼的6個蛋白質氨基酸序列相似度進行比較分析（表5），結果顯示，楊凌3個分離物和越南番茄黃化曲葉病毒TYLCVNV、以色列TYLCV-IS轉錄激活子TrAP的氨基酸序列完全相同。TYLCV- SXYL3、 SXYL4和山東壽光分離物TYLCV-SDSG及河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1復制增強子REn的氨基酸序列完全相同，且與TYLCV-IS的REn氨基酸序列相比，第58位由纈氨酸（Valine， V）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，A）、第59位由甲硫氨酸（Methionine，M）突變?yōu)榱涟彼幔↙eucine，L）、第94位由天冬氨酸（Aspartic acid，D）突變?yōu)槔野彼幔═yrosine，Y）、第124位由谷氨酸（Glutamic acid，E）突變?yōu)楸彼帷YLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和日本分離物TYLCV-Japan、山東壽光分離物TYLCV-SDSG、上海分離物TYLCV-SH2、河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1的C4蛋白氨基酸序列完全相同，與TYLCV-IS的C4蛋白氨基酸序列相比，第64位由脯氨酸（Proline，P）突變?yōu)榻z氨酸（Ser，S）、第67位由甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔↖soleucine，I）、第84位由賴氨酸（Lysine，K）突變?yōu)榫彼幔ˋrginine，R）。

通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進行跨膜結構預測發(fā)現，CP、 Rep、REn存在跨膜結構（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質的跨膜結構的預測結果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數和親水性平均系數進行預測和比較分析（表6），發(fā)現楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結論

為了進一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標準[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產區(qū)調查采樣并對全基因組進行了測序和基因組結構分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農林科技大學園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產區(qū)在2011年相繼發(fā)現番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進化樹構建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結果發(fā)現，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質間的氨基酸相似度、蛋白質的理化特性和跨膜結構進行了生物信息學分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

參考文獻

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[13] Verlaan M G， Hutton S F， Ibrahem R M， et al. The tomato yellow leaf curl yirus resistance genes Ty-1 and Ty-3 are allelic and code for DFDGD-Class RNA-dependent RNA polymerases[J]. PLoS Genetics， 2013， 9（3）： e1003399.

通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進行跨膜結構預測發(fā)現，CP、 Rep、REn存在跨膜結構（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質的跨膜結構的預測結果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數和親水性平均系數進行預測和比較分析（表6），發(fā)現楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結論

為了進一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標準[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產區(qū)調查采樣并對全基因組進行了測序和基因組結構分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農林科技大學園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產區(qū)在2011年相繼發(fā)現番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進化樹構建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結果發(fā)現，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質間的氨基酸相似度、蛋白質的理化特性和跨膜結構進行了生物信息學分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

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[12] 阮濤，楊會房，楊水英，等.分離自陜西涇陽番茄的番茄黃化曲葉病毒 （TYLCD）的分子特征[J].農業(yè)生物技術學報，2013，21（1）：97-105.

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通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進行跨膜結構預測發(fā)現，CP、 Rep、REn存在跨膜結構（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質的跨膜結構的預測結果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數和親水性平均系數進行預測和比較分析（表6），發(fā)現楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結論

為了進一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標準[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產區(qū)調查采樣并對全基因組進行了測序和基因組結構分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農林科技大學園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產區(qū)在2011年相繼發(fā)現番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進化樹構建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結果發(fā)現，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質間的氨基酸相似度、蛋白質的理化特性和跨膜結構進行了生物信息學分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

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