盧生有，劉秀梅，馬洪菲，楊翔華，王戰(zhàn)勇

（遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧撫順113001）

豆瓣醬發(fā)酵種曲紅曲霉LLMY-18的篩選分離

盧生有，劉秀梅，馬洪菲，楊翔華*，王戰(zhàn)勇

（遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧撫順113001）

從麥芽汁培養(yǎng)基中利用秈米分離菌株，通過(guò)平板篩選和固體培養(yǎng)的方法，篩選分離獲得一株優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、高產(chǎn)、周期適合的紅曲霉菌株LLMY-18。此菌株在發(fā)酵周期和發(fā)酵條件方面與豆瓣醬所需的條件相似，產(chǎn)紅色素的能力大大提高，可將其應(yīng)用到豆瓣醬的加工生產(chǎn)中。初步表明，紅曲霉LLMY-18參與發(fā)酵制成的紅曲豆瓣醬具有色澤紅潤(rùn)、口感醇厚、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)。

紅曲霉；篩選；豆瓣醬

紅曲霉是以秈米為原料，在傳統(tǒng)基礎(chǔ)上，通過(guò)菌種純化平板分離篩選方法精致而成。紅曲霉可作為食品染料加入發(fā)酵的食品中，如肉、飲料、蔬菜及大豆凝乳中[1]，并具有良好的治療性能，可以利用其促進(jìn)色素的合成[2-3]，其中的有些成分對(duì)健康十分有益，如對(duì)“三高”的防治和抗細(xì)胞腫瘤癌等作用[4]。在對(duì)紅曲霉的深入研究過(guò)程中，其被發(fā)掘出來(lái)的藥用價(jià)值也被應(yīng)用在醫(yī)藥和食品等多個(gè)行業(yè)中[5]。與已知的天然色素相比，其在具有天然色素的一般特性的同時(shí)又具有較強(qiáng)的耐熱性、穩(wěn)定性與對(duì)蛋白質(zhì)良好的著色性等優(yōu)點(diǎn)[6]。

本研究的目的是欲將其應(yīng)用到豆瓣醬中，在滿(mǎn)足傳統(tǒng)豆瓣醬的形、香、味方面的同時(shí)，突出了紅曲霉的色，同時(shí)也更有利于健康。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 原料

麥芽粉、玉米粉、黃豆芽、秈米、瓊脂、豆餅、大米、乙醇、乳酸。

1.2 設(shè)備

SHP-1500生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-40KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ALC-210.4電子分析天平；SL-219A冷藏柜（4℃）；DZF一6020型真空干燥箱；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 麥芽汁培養(yǎng)基

稱(chēng)取適量的麥芽粉，用3倍重量的水（55℃～60℃）進(jìn)行調(diào)漿，然后放置在水浴箱中糖化3.5 h～5.5 h。將煮沸的液體用雙層紗布進(jìn)行過(guò)濾，得到麥芽汁，調(diào)節(jié)pH為3.5～3.8。在121℃下滅菌20min。

1.3.2 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基

取一定量麥芽汁，調(diào)pH為5.0～5.8，加2%（W/V）瓊脂，熔化后于121℃滅菌20min。

1.3.3 黃豆芽培養(yǎng)基

取80 g黃豆芽，加水煮沸20 min，過(guò)濾，定容至800mL，加入葡萄糖30g，滅菌，再加50%的乙醇6mL。

1.3.4 馬鈴薯培養(yǎng)基

配制20%馬鈴薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入磷酸二氫鉀2.5 g，硫酸鎂15 g，瓊脂20 g，葡萄糖22 g，VC8mg，加熱溶解后補(bǔ)足水分，調(diào)整pH到6。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基

豆餅粉10 g，加水混勻，于121℃糊化55min，冷卻至50℃，加淀粉酶3g糖化15min。再加0.3g（NH4）2SO4、0.1 gMgSO4、0.2 gK2HPO4，加水定容至100mL，調(diào)pH為5.0～6.0，然后于121℃滅菌30min。

1.3.6 孢子培養(yǎng)基

將25 g大米泡5 h后加入20mL水，于121℃滅菌20min。

1.4 方法

1.4.1 菌種來(lái)源

取麥芽汁分裝入3支試管中（5mL/管），滅菌后加95%乙醇2滴。在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將秈米研碎，取0.15 g左右于試管內(nèi)，在28℃～34℃培養(yǎng)。

1.4.2 純化方法

從長(zhǎng)勢(shì)均勻的培養(yǎng)管內(nèi)，挑出紅色菌體少許，分別置于黃豆芽培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基中，在28℃～34℃培養(yǎng)、觀察。待紅色菌體長(zhǎng)出后，再將純化后的紅色菌體挑取少許置于滅菌生理水中，搖動(dòng)至均勻。

1.4.3 培養(yǎng)

將純化后的紅曲霉菌種用接種環(huán)接種到滅菌后的麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在30℃～34℃培養(yǎng)48 h，然后挑取成熟、穩(wěn)定的紅色菌體置于無(wú)菌生理鹽水中，搖勻。將少量懸液滴到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上。觀察紅曲霉孢子和菌落的產(chǎn)生情況。

1.4.4 平板分離篩選

以無(wú)菌水刮洗斜面菌種的孢子，將其注入帶玻璃球的錐型瓶中，搖勻，得到孢子懸液。

1.4.5 梯度稀釋孢子懸液

吸取1mL的孢子懸液注入9mL的無(wú)菌水中，即可得到10-1濃度倍數(shù)的孢子懸液。然后取10-1濃度倍數(shù)的孢子懸液1mL注入9mL無(wú)菌水中，即得10-2濃度倍數(shù)的孢子懸液。以此類(lèi)推，可制得10-3、10-4濃度倍數(shù)的孢子懸液。

吸取原液10-1、10-2、10-3、10-4濃度倍數(shù)懸液各0.15mL注入平板，以無(wú)菌涂棒涂布均勻，編號(hào)。送入培養(yǎng)箱中在28℃下培養(yǎng)7 d。

根據(jù)單個(gè)菌落的顏色及長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)，挑取8個(gè)接種至斜面上培養(yǎng)，送入培養(yǎng)箱中，在30℃下培養(yǎng)7 d。

將斜面培養(yǎng)的8個(gè)單個(gè)菌落分別接種至三角瓶中，在搖床上（溫度28.5℃，轉(zhuǎn)速200 r/min）培養(yǎng)，4 d后下?lián)u床，分別測(cè)每瓶發(fā)酵液OD值，轉(zhuǎn)換成色價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)特征

將菌株在查氏酵母瓊脂上27℃培養(yǎng)，5 d后，菌落的直徑達(dá)21mm，表面呈毛狀，邊緣呈流蘇狀，菌落的顏色從中間開(kāi)始由白色向粉紅色慢慢轉(zhuǎn)變，但由于菌絲在繼續(xù)生長(zhǎng)，周邊的顏色仍為白色，可以看出此菌株已經(jīng)開(kāi)始向培養(yǎng)基分泌色素物質(zhì)。

2.2 顯微鏡觀察

在顯微鏡下，菌絲直徑2μm～6μm，分枝狀且具有橫隔，呈橢球形，里面含有密集的孢子，分生孢子一般著生在菌絲的頂端，呈犁形，基部平截，成熟后為圓形。2.3平板分離出八株菌種產(chǎn)的色素情況

通過(guò)測(cè)色價(jià)可知其產(chǎn)色素的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 平板分離菌株產(chǎn)色素結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table1 Flat panel separation strain producing pigment statistics result

2.4 應(yīng)用結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他條件相同，不同的紅曲霉菌株產(chǎn)色素的水平不同。以上的八株菌種中編號(hào)為018和156二株的產(chǎn)色素的水平較高，且發(fā)酵周期與豆瓣醬相同，因此可作為紅曲霉豆瓣醬發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)的菌種。

3 結(jié)論

用3種選擇分離培養(yǎng)基分離到產(chǎn)紅色素霉菌菌株，通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)篩選出產(chǎn)紅色素能力比較強(qiáng)的編號(hào)為018和156菌株，此2株菌在馬鈴薯培養(yǎng)基和黃豆芽培養(yǎng)基上差別不大。通過(guò)形態(tài)特征與顯微鏡觀察，根據(jù)李鐘慶等和郭紅珍等[7]對(duì)紅曲霉的有關(guān)描述，可以鑒定出編號(hào)為018和156的菌株為紅曲霉菌株，尤其018菌株在黃豆芽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，利于產(chǎn)色素，且周期與豆瓣醬制作周期相同，將其命名為L(zhǎng)LMY-18。說(shuō)明，該菌株具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可以在固體和液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，適宜應(yīng)用于新型豆瓣醬的加工生產(chǎn)。

[1]Lin CF.Isolation and culture condition of Monascus sp.for the production of pigment in submerged culture[J].J Ferment Technol, 1973,51:407-414

[2]Pastrana L,P J Blanc,M O Santerre,et al.Production of red pigments by Monascusruber in synthetic media with a strictly controlled nitrogen source[J].Process Biochem,1995,30:333-341

[3]Chen M H,M R Johns.Effect of pH and nitrogen source on pigment production by Monascus purpureus[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1993,40:132-138

[4]逯慎杰,劉秀河．功能性紅曲中功能成分的研究進(jìn)展[J].調(diào)味副食品,2011(1):17-21

[5]張菲菲,周立平,嘉曉勤,等.紅曲菌應(yīng)用研究進(jìn)展[J].釀酒科技, 2009(7):91-94

[6]賴(lài)建平,羅軍,古卓鑫．紅曲色素穩(wěn)定性探討[J]．廣州大學(xué)學(xué)報(bào), 1999,13(4):56-60

[7]郭紅珍．山西老陳醋大曲紅曲霉分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D]．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文,2004

Screening and Separating of Soy Sauce Koji Fermentation Strain Monascus sp.LLMY-18

LU Sheng-you，LIU Xiu-mei，MA Hong-fei，YANG Xiang-hua*，WANG Zhan-yong
（Liaoning Shihua University Chemical and Environmental Sciences，F(xiàn)ushun 113001，Liaoning，China）

From the wort medium indica rice strains using，through the flat filter and solid culture method，the screening separation was obtained，stable quality，high yield，cycle for Monascus strain LLMY-18.The strains in the fermentation cycle and fermentation conditions and bean sauce of the same，pigments production capacity greatly increased，which can be applied to the production of soy sauce.Preliminary results suggest that LLMY-18 is involved in the fermentation of Monascus，made of red bean paste with ruddy color，mellow taste，taste delicious etc.

monascus；screening；bean paste

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.024

2012-11-03

盧生有（1991—），男（漢），本科，從事生物發(fā)酵學(xué)習(xí)和研究工作。

*通信作者：楊翔華（1959—），男（漢），教授，博士，研究方向：微生物資源開(kāi)發(fā)及發(fā)酵工程。