潘曉韻，沈曉嵐，朱開元，劉慧春，鄒清成

（浙江省蕭山棉麻研究所，浙江蕭山 311202）

鳥巢蕨的組培快繁技術(shù)

潘曉韻，沈曉嵐，朱開元，劉慧春，鄒清成

（浙江省蕭山棉麻研究所，浙江蕭山 311202）

以背面帶有褐色孢子的鳥巢蕨葉片為外植體，通過孢子萌發(fā)途徑組培快繁鳥巢蕨。擴(kuò)繁數(shù)量不大時(shí)，可全程采用1/2MS+AC1g·L-1培養(yǎng)基。在原葉體生長階段需要原葉體達(dá)到一定的數(shù)量和密集程度時(shí)配子間才有較大可能結(jié)合產(chǎn)生孢子體，一般原葉體層厚度需達(dá)0.5～1cm才有孢子體長出。孢子體增殖階段在MS培養(yǎng)基中加入6-BA能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生GGB，通過GGB途徑進(jìn)行增殖，GGB在不含或含有低濃度NAA，IBA的培養(yǎng)基上易分化成苗。

鳥巢蕨；組織培養(yǎng)；原葉體；孢子體；GGB

鳥巢蕨（Aspleniumnidus）為鐵角蕨科巢蕨屬植物，主要分布于亞洲、非洲和澳洲，為多年生常綠附生植物。葉叢生，向四周輻射狀排列，呈鳥巢狀。鳥巢蕨耐陰性強(qiáng)，較耐低溫，病蟲害少，管理簡便，可連續(xù)多年栽培，作室內(nèi)觀葉布景及切葉栽培。近年來被用作高檔葉菜栽培，因栽培期間無需噴施農(nóng)藥，嫩葉炒食質(zhì)脆爽口，無苦澀味，頗受喜愛，成為道地的原生蔬菜。鳥巢蕨主要靠孢子繁殖，但繁殖要求條件高，自然條件下難以萌發(fā)。組織培養(yǎng)可以在短期內(nèi)獲得大量種苗，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

以背面帶褐色孢子的鳥巢蕨葉為試材。

1.2 方法

1.2.1 無菌材料的獲得

葉片經(jīng)流水沖洗1h后，用70%酒精浸泡20～30s，用無菌水沖洗后，在0.1%升汞中浸泡8～10min，再用無菌水沖洗并吸干水分后，切成0.5～1cm見方的小塊，接種于孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為20～25℃，光強(qiáng)2000lx，光照時(shí)間10h·d-1。

1.2.3 培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基加蔗糖30g·L-1，1/2MS和2/3MS培養(yǎng)基加蔗糖20g·L-1，瓊脂均為5g·L-1，pH為5.8，AC為活性炭（表1）。

表1 鳥巢蕨組培各階段培養(yǎng)基配方

1.2.4 其他處理

在原葉體生長階段的B1～B4各取6瓶加數(shù)滴無菌水，其中各取3瓶每周搖晃1次，持續(xù)2個(gè)月，另3瓶靜置。B1～B4各6瓶不加無菌水為對照。

將B2上1～1.5cm的鳥巢蕨小苗分別接入D1～D6培養(yǎng)基，每瓶4株，每種培養(yǎng)基8瓶，45d轉(zhuǎn)接1次，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)根數(shù)，測量每株最長4根的根長，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子的萌發(fā)

帶孢子葉在A1，A2培養(yǎng)基上經(jīng)過1個(gè)月左右的培養(yǎng)，孢子萌發(fā)，可見許多綠色小點(diǎn)，即原葉體。無論葉面或葉背朝上，孢子均能萌發(fā)。

2.2 原葉體生長及孢子體形成

原葉體在不加6-BA的B1，B2培養(yǎng)基上生長快，顏色鮮綠；在培養(yǎng)基B3，B4上的則逐漸變黃，生出許多絨毛；在培養(yǎng)基B3上尚有緩慢生長，在B4中生長停滯，幾個(gè)月后變成內(nèi)核堅(jiān)硬的絨球。說明6-BA不利于原葉體的生長，濃度越高抑制越強(qiáng)［1-3］。NAA對原葉體生長無明顯促進(jìn)作用。當(dāng)B3，B4培養(yǎng)基上的原葉體轉(zhuǎn)入B1，B2培養(yǎng)基后，很快恢復(fù)生長。

在前7個(gè)月中，不論有無添加無菌水及是否晃動培養(yǎng)瓶，原葉體在4種培養(yǎng)基上都無孢子體產(chǎn)生。第8個(gè)月在B1，B2培養(yǎng)基中可見少量孢子體，培養(yǎng)基B3，B4上原葉體始終未見孢子體產(chǎn)生，轉(zhuǎn)入B1，B2培養(yǎng)基一段時(shí)間后才可見孢子體萌出。

培養(yǎng)前期的4種培養(yǎng)基，不論有無加入無菌水的培養(yǎng)瓶，定期晃動和靜置的都無孢子體萌出，說明在原葉體數(shù)量較少、分布分散的情況下，為擴(kuò)大配子的活動范圍，促進(jìn)配子間的結(jié)合，采取添加無菌水和晃動培養(yǎng)瓶的措施是無效的。

第8個(gè)月在B1，B2培養(yǎng)基上原葉體已長成0.5～1cm的厚層，而B3的原葉體尚未填滿接種塊間的空隙，且為黃色絨毛狀，B4上原葉體更是形成幾個(gè)孤立的絨球。當(dāng)B3，B4上的原葉體轉(zhuǎn)到B1，B2培養(yǎng)一段時(shí)間后開始產(chǎn)生孢子體時(shí)，其顏色、數(shù)量和擁擠程度與第8個(gè)月B1，B2上的原葉體相仿。這說明只有原葉體達(dá)到一定的數(shù)量和密集程度時(shí)配子間才有較大可能結(jié)合產(chǎn)生孢子體。B1，B2上后續(xù)產(chǎn)生的孢子體越來越多也證明了這一點(diǎn)。

2.3 孢子體增殖

孢子體接入C1～C5培養(yǎng)基初期表現(xiàn)出不同程度的生長停滯，6-BA濃度越高停滯越明顯，2～3個(gè)月后孢子體中央可觀察到成團(tuán)GGB（綠色球狀體）的產(chǎn)生。其中C1，C2產(chǎn)生的GGB數(shù)量少，單個(gè)體積大，GGB團(tuán)塊顯得較大（圖1）。C3，C4，C5產(chǎn)生的GGB多而小，數(shù)量隨6-BA濃度增加而增加，體積隨6-BA濃度增加而變小，孢子體變厚變硬、葉卷曲皺縮?？傮w表現(xiàn)與先前他人［2，4］的試驗(yàn)結(jié)果類似。在C1～C5培養(yǎng)基上，GGB都能不斷增殖。但GGB在C1，C2上能長出孢子體植株，在C3～C5上則長期以GGB的形態(tài)存在。

圖1 孢子體誘導(dǎo)產(chǎn)生GGB和壯苗促根

2.4 孢子體壯苗和促根

GGB轉(zhuǎn)入D1～D6培養(yǎng)基后迅速長成孢子體植株（圖1）。在D1～D6接入大小一致的鳥巢蕨已生根小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)基試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 不同培養(yǎng)基對鳥巢蕨生根的影響

不同生根培養(yǎng)基處理間的鳥巢蕨根數(shù)無顯著差異。根長D6顯著長于D3，極顯著長于D5，D2，D4，D1顯著長于D4，說明活性炭、NAA、IBA主要影響鳥巢蕨根的長度，對根的數(shù)量無顯著影響。隨著IBA，NAA濃度增加，根長度也增加，活性炭對根的伸長也有較好的促進(jìn)作用。

2.5 出瓶移栽

在春秋季將鳥巢狀3～4cm高的小苗從培養(yǎng)瓶取出，清洗掉培養(yǎng)基，盡量避免傷根，以800倍多菌靈或1000倍的甲基托布津蘸根和基部，移植到進(jìn)口泥炭為基質(zhì)的穴盤中，放入大棚，遮陰保濕約1個(gè)月，可每周噴施低濃度葉面肥，待小苗落黃的葉色重新轉(zhuǎn)鮮綠，新根長出，可逐步增加光照，降低濕度。2個(gè)月后調(diào)查，成活率可達(dá)90%。

3 小結(jié)與討論

鳥巢蕨作為1種蕨類植物，有孢子體和配子體2個(gè)世代。在配子體世代，不加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基更適合其孢子萌發(fā)和原葉體生長增殖，此結(jié)果與劉洋［1］、秦廷豪等［2］一致。產(chǎn)生的原葉體量較少造成培養(yǎng)時(shí)間偏長，可能與0.1%升汞滅菌時(shí)間超過8min而影響孢子活力有關(guān)［3］。鳥巢蕨孢子體的產(chǎn)生要求培養(yǎng)瓶內(nèi)有一定數(shù)量和密集程度的原葉體，以利于配子間的融合，此現(xiàn)象和張善信等［3］通過振蕩培養(yǎng)獲得孢子體植株原理相同，所以原葉體在固體培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)接不能像一般的繼代轉(zhuǎn)接那樣保持間距，留出生長空間，而要有一定的密集程度，不能太稀疏。

如果要求組培的鳥巢蕨數(shù)量不大，而原葉體已擴(kuò)繁至一定數(shù)量，則可以不進(jìn)行孢子體增殖階段培養(yǎng)，僅通過原葉體產(chǎn)生的配子間結(jié)合自然長出鳥巢蕨小植株，組培全程可采用同1種培養(yǎng)基MS+AC 1.0g·L-1。如果要求數(shù)量較大，則采用孢子體增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基6-BA濃度不宜過高，建議不超過1mg·L-1，以免雖GGB增殖數(shù)量多但個(gè)體微小，從而延長后續(xù)培養(yǎng)時(shí)間。添加低濃度的NAA或IBA能夠促進(jìn)GGB成苗。

生根壯苗階段，NAA，IBA和活性炭的作用主要是增加根的長度而非數(shù)量。但考慮到鳥巢蕨的根在出瓶種植時(shí)易斷，不同生根培養(yǎng)基間差異對后續(xù)生長的影響沒有出瓶時(shí)那么明顯。

由于種植時(shí)大部分根系受到損傷，鳥巢蕨組培苗的煉苗時(shí)間比一般草本植物組培苗要長，至新根長出約需1個(gè)月，與他人［5-7］的試驗(yàn)結(jié)果類似。但只要苗高達(dá)3～4cm，植株生長健壯，煉苗階段保持適宜的溫度和濕度，無根苗也能有較高的成活率。

［1］ 劉洋.蕨組培快繁技術(shù)研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（5）：1188-1189.

［2］ 秦廷豪，鄒宗蘭.鳥巢蕨的組織培養(yǎng)［J］.植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：349.

［3］ 張善信，范俊強(qiáng)，鄭貴朝，等.鳥巢蕨孢子繁殖技術(shù)研究［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2012，41（4）：48-50.

［4］ 尹鐵龍，孫平平.蕨類植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.園藝與種苗，2012（3）：59-61.

［5］ 王宏航，李朝森，劉慧琴.觀賞蕨類植物組培快繁及其移栽技術(shù)［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18（5）：125-126.

［6］ 陳金典.鳥巢蕨組織培養(yǎng)育苗技術(shù)研究［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2010（2）：44-46.

［7］ 李楊，余蓉培，李慧，等.觀賞蕨類植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報(bào)，2012，39（9）：1839-1848.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S682.35文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號：0528-9017（2014）07-1049-02

文獻(xiàn)著錄格式：潘曉韻，沈曉嵐，朱開元，等.鳥巢蕨的組培快繁技術(shù)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（7）：1049-1050，1053.

2014-02-28

潘曉韻（1967-），女，浙江蕭山人，助理研究員，從事花卉組培與育種研究工作。E-mail：panxy06@163.com。