華碧春，黃智鋒，劉嬌，程心玲，陳小峰，王英豪，卓實(shí)

·藥理毒理·

黃藥子及配伍甘草對(duì)大鼠肝臟CYP450基因表達(dá)的影響

華碧春1，黃智鋒1，劉嬌1，程心玲2，陳小峰3，王英豪1，卓實(shí)2

目的：考察甘草對(duì)黃藥子引起的肝損傷的CYP450酶基因表達(dá)的影響。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表達(dá)。結(jié)果：在mRNA水平上，28天、35天黃藥子組均顯著誘導(dǎo)CYP1A2的基因表達(dá)，配伍甘草后表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甘草組可微弱下調(diào)CYP2C19的表達(dá)，但與配伍組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：甘草通過(guò)抑制CYP1A2的mRNA表達(dá)，對(duì)黃藥子致肝損傷具有一定保護(hù)作用。

黃藥子；甘草；CYP450；基因表達(dá)；配伍減毒

中藥致肝損害已成為我國(guó)中藥安全性評(píng)價(jià)面臨的重要問(wèn)題。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)有包括草藥和非法藥物在內(nèi)的大于1100種的藥物可引起肝損害[1]，國(guó)內(nèi)已報(bào)道有100 多種中草藥和30 多種中成藥可引起肝損害[2]。肝臟是大部分藥物轉(zhuǎn)化代謝的場(chǎng)所，有研究表明藥物性肝損害的發(fā)生與肝組織內(nèi)細(xì)胞色素P450的高表達(dá)密不可分[3]。本實(shí)驗(yàn)以前期實(shí)驗(yàn)[4～6]為基礎(chǔ)，通過(guò)大鼠肝臟CYP450基因mRNA表達(dá)的影響來(lái)探究黃藥子甘草1∶2配伍組減輕黃藥子致大鼠肝損傷時(shí)間蓄積性的實(shí)驗(yàn)機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃藥子飲片，產(chǎn)地四川，批號(hào)120724，購(gòu)自福建回春醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú)Dioscorea bulbifera L.的塊莖。甘草飲片，產(chǎn)地甘肅，批號(hào)12030506，購(gòu)自福建回春醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza infata Bat.的干燥根和根莖。

Trizol（Lot:15596-026，Invitrogen），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (RT-PCR，Lot: 00102205，F(xiàn)ermentas)，DreamTaq? Green PCR Master Mix (Lot: 00124582，F(xiàn)ermentas) ，50bp DNAmarker（Lot:1304G15，上海捷瑞生物工程有限公司） CYP1A2、CYP2C19、β-actin引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf）、PCR擴(kuò)增儀（S1000TM Thermal Cycler 美國(guó)BIO-RAD）、冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）、電泳儀（美國(guó)BIO-RAD）、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM XR+ Imaging System美國(guó)BIO-RAD）。

2 方法

2.1 藥液制備

黃藥子飲片烘干，粉碎，8倍量水浸泡60 min，煎煮60 min；2次煎煮5倍量水煎煮30 min，合并2次藥液；過(guò)濾，經(jīng)3000 r．min-1離心 10 min，除去藥渣，再次濃縮至1 g．mL-1（以黃藥子生藥量計(jì)，下同）。黃藥子甘草1∶2配伍組(后文簡(jiǎn)稱“配伍組”)合煎液同法煎煮制備，濃縮至1 g．mL-1。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

雄性SD大鼠，體重200±20 g，隨機(jī)分為6組，按給藥劑量： 9 g．kg-1（黃藥子組）、9 g．kg-1（配伍組，黃藥子生藥量）和空白對(duì)照組（等體積蒸餾水）。分別于灌胃28天和35天處死，迅速取出肝臟，置液氮中保存。

2.3 CYP1A2、CYP2C19 mRNA表達(dá)

應(yīng)用Invitrogen公司的TRIzol?試劑、氯仿及異丙醇試劑提取大鼠肝臟組織中的總RNA，測(cè)得A260/ A280比值1.8～2.0，所提總RNA可用。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以Fermentas公司的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作，逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 60 min、70℃ 5 min，合成第一條cDNA鏈。PCR反應(yīng)以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.0 μL為模板，加入上下游引物各0.8 μL，Green PCR Master Mix 10 μL，Rnase-free H2O 7.4 μL，使反應(yīng)終體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；循環(huán)時(shí)95℃ 30 s，CYP1A2、β-actin 53℃退火30 s、CYP2C19 47℃退火30 s，72℃延伸30 s；擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)分別為35、35、32；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量比較鑒定后，在數(shù)字成像儀拍照、分析。特異性引物序列見表1。

表1 CYP 1A2、CYP2C19、β-actin基因引物序列信息

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

由表2、圖3可見：與空白組比較，28天、35天黃藥子組均上調(diào)了CYP1A2的mRNA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），且35天組較28天組誘導(dǎo)作用更顯著（P＜0.01）；與黃藥子組比較，28天、35天配伍組抑制了CYP1A2的mRNA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；28天、35天黃藥子組、配伍組上調(diào)了CYP 2C19 的mRNA的表達(dá)，但表達(dá)無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 黃藥子及配伍甘草對(duì)大鼠肝臟CYP450亞型mRNA表達(dá)水平的影響（）

表2 黃藥子及配伍甘草對(duì)大鼠肝臟CYP450亞型mRNA表達(dá)水平的影響（）

注：與對(duì)應(yīng)天數(shù)空白組比較 a P＜0.05，c P＜0.01，e P＞0.05；與對(duì)應(yīng)天數(shù)黃藥子組比較 b P＜0.05，d P＜0.05，f P＞0.05

組別 CYP1A2/β- actin CYP2C19/β- actin 動(dòng)物數(shù)（n）28天黃藥子組 2.415±1.432a 1.358±0.955e 10 28天配伍組 1.053±0.261b 1.099±0.677f 9 28天空白組 1.082±0.175 0.743±0.503 8 35天黃藥子組 2.283±1.032c 1.350±0.420e 10 35天配伍組 1.325±0.561d 1.015±0.358f 9 35天空白組 1.232±0.586 0.985±0.395 8

圖3 不同處理組CYP1A2、CYP2C19 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

4 討論

4.1 中藥配伍理論作為中醫(yī)藥理論的重要組成部分，已有幾千年的應(yīng)用歷史，配伍減毒更是臨床常用的有效手段。配伍后的作用機(jī)制已成為近幾年中藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)，本研究正是應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟CYP450酶mRNA的表達(dá)影響，探討甘草減輕黃藥子肝毒性的作用機(jī)制。

4.2 現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，CYP450 酶的誘導(dǎo)或抑制是藥物相互作用最常見的原因之一。CYP1A2與藥物代謝關(guān)系較為密切，其占肝臟總P450氧化酶含量的13%，僅次于CYP3A和CYP2C家族，參與了黃曲霉毒素B1、多環(huán)芳烴等前致癌物以及咖啡因、非那西丁硝苯地平、丙咪嗪等20 余種藥物的代謝活化過(guò)程，其在內(nèi)源性底物和環(huán)境毒素的代謝過(guò)程中起到了重要作用；CYP 2C家族占成人肝微粒體CYP450總量的20%左右，能代謝巴比妥類、丙咪嗪、奧美拉唑、華法林等藥物，多數(shù)內(nèi)源性底物、前致癌物、前毒物、臨床大約2%的藥物的代謝及毒性反應(yīng)與CYP2C19相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道[7]，黃藥子的不良反應(yīng)主要是引起肝損害，且其對(duì)肝臟的損害屬于對(duì)肝細(xì)胞直接毒性作用。因此，通過(guò)CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表達(dá)研究甘草減輕黃藥子致肝臟毒性損害及臨床合理應(yīng)用黃藥子具有重要意義。

4.3 本研究結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥配伍理論，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及文獻(xiàn)資料的報(bào)道，同時(shí)根據(jù)臨床病例長(zhǎng)期、大量服用黃藥子及其制劑的特點(diǎn)，通過(guò)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C19的mRNA表達(dá)的影響探究黃藥子甘草1∶2配伍組減輕黃藥子致大鼠肝損傷時(shí)間蓄積性的實(shí)驗(yàn)機(jī)制。28天、35天黃藥子組均顯著上調(diào)了CYP1A2的mRNA表達(dá)，配伍甘草后CYP1A2的mRNA表達(dá)降低。提示甘草可能通過(guò)抑制CYP1A2的mRNA表達(dá)，對(duì)黃藥子致肝損傷有保護(hù)作用。28天、35天黃藥子組對(duì)CYP2C19基因表達(dá)有一定誘導(dǎo)作用，然配伍甘草后表達(dá)微弱下降，但與黃藥子組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可見CYP2C19雖與多數(shù)內(nèi)源性底物、前致癌物、前毒物代謝及毒性反應(yīng)有關(guān)，但該基因并不參與黃藥子致肝損傷的調(diào)控；抑或是因?yàn)镃YP2C19存在遺傳多態(tài)性，存在多個(gè)等位基因，黃藥子致肝損傷是否與CYP2C19多態(tài)性等位基因的mRNA表達(dá)有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。4.4 CYP450酶作為藥物代謝重要酶系，在中藥配伍增效減毒上起著重要作用。黃藥子苦寒，攻散之性較強(qiáng)，治療癌腫、甲狀腺疾患用藥時(shí)間長(zhǎng)，易耗正氣；甘草能緩和黃藥子苦寒之性，補(bǔ)脾益氣、保肝利膽、清熱解毒。本實(shí)驗(yàn)從基因水平探討黃藥子肝損傷及配伍甘草減毒的機(jī)制，豐富和發(fā)展了中藥甘緩解毒的藥性理論和相畏、相殺的配伍理論，為臨床合理應(yīng)用黃藥子提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。下階段，我們將繼續(xù)對(duì)CYP1A2、CYP2C19酶含量和活性及蛋白表達(dá)的影響深入研究，同時(shí)增加與肝損傷相關(guān)的CYP亞型的實(shí)驗(yàn)，以闡明黃藥子致肝損傷的機(jī)制及甘草減輕黃藥子肝毒性的作用機(jī)制。

[1] Jonathan G Stine,James H Lewis.Durg-induced liver injury: a summery of recent advances[J].Expert Opin.Drug Metab. Toxicol,2011,7(7):875.

[2] 華碧春,盧榜華.中草藥的藥物性肝損害[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,10(1):30.

[3] Pelkonen O,Raunio H.Metabolic activation of toxins: tissuespecifc expression and metabolism in target organs[J].Environ Health Perspect,1997,105:767.

[4] 華碧春,胡娟,王瑞國(guó),等.甘草降低黃藥子致小鼠肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,6(1):24.

[5] 華碧春,馬麗娜.黃藥子配伍甘草分煎液與合煎液中黃獨(dú)乙素含量的比較[C].第五屆全國(guó)臨床中藥學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2012:215.

[6] 華碧春,卓實(shí),史道華,等.甘草減輕黃藥子肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,23(1):23.

[7] 唐迎雪.黃藥子古今臨床應(yīng)用研究[J].中國(guó)中藥雜志,1995,20 (7):435.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat liver

HUA Bi-chun1, HUANG Zhi-feng1,LIU Jiao1, CHENG Xin-ling2, CHEN Xiao-feng3, WANF Ying-hao1,ZHUO Shi2//(1.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122; 2.The First Affliated Hospital of Fujian Province, Fuzhou 3500042; 3.The Second People’s Hosptial of Fujian Province, Fuzhou 3350003)

Objective:To study the effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat livers.Method:The mRNA levers of the expression of the CYP1A2 and CYP2C19 gene of the rat liver were assayed with RT-PCR. Result: The mRNA levels of CYP1A2 were induced signifcantly by group of Huangyaozi after medication for 28 days and 35 days separately and reduced after given the compatibility with Gancao. Conclusion: The mRNA expression of CYP1A2 was inhibited by Gancao to protect liver from injury which caused by Huangyaozi.

Huangyaozi; Gancao; CYP 450; gene expression; decrease toxicity by compatibility

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-005-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：81274105）

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省人民醫(yī)院，福建 福州 350004；3.福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

華碧春(1962- )，女，主要從事中藥學(xué)研究Email:1625399195@qq.com

2013-10-21