向暉，潘曉麗，譚玉柱，吳兵，陸小華，董小萍

·藥理毒理·

大黃酸金屬配合物的抑菌活性研究

向暉，潘曉麗，譚玉柱，吳兵，陸小華，董小萍

目的：合成大黃酸的三種金屬配合物并對其結(jié)構(gòu)進行表征，對比研究配體和配合物對三種細菌的體外抑菌活性大小。方法：在無水乙醇中合成了大黃酸的三種金屬配合物，采用紫外光譜法，紅外光譜法，核磁共振氫譜法對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行表征，確定了配合物的組成及結(jié)構(gòu)。采用二倍稀釋法測定了配合物的最小抑菌濃度（MIC），采用濾紙片法測定了配體及配合物對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑菌活性大小。結(jié)果：合成的配合物經(jīng)結(jié)構(gòu)表征后，初步確定了其可能結(jié)構(gòu)式為2分子大黃酸和1分子金屬離子配位，抑菌活性測試結(jié)果表明，配合物的抑菌活性強于配體，其中大黃酸錳對于金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌抑制作用都最強，抑菌圈大小分別達到了23.3、20.5 mm；而大黃酸鈷對肺炎鏈球菌抑菌活性最強，抑菌圈達22.5 mm。二倍稀釋法得出了配合物和配體的MIC值（最小抑菌濃度），根據(jù)該值大小可知，配合物抑菌活性總體上強于配體，但也有少部分與配體相當。結(jié)論：大黃酸和金屬離子形成配合物后，抑菌活性增強。

大黃酸；濾紙片法；二倍稀釋法；金屬配合物；抑菌

大黃酸（Rhein，見圖1)，來源于蓼科植物大黃、何首烏、虎杖等中藥中，屬于單蒽核類1，8—二羥基蒽醌衍生物[1]。來源豐富，易于提純。大黃酸藥理作用廣泛，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌[2]以及保肝[3]等活性，具有臨床藥用價值。大黃酸對于金黃色葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌等均有較強的抑制作用。其抑制細菌繁殖的機制可能是：抑制細菌糖代謝，以及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化，脫氫以及抑制蛋白質(zhì)與核酸的合成[4]。中藥配位學(xué)說認為：可能是有機成分與微量元素組成的配位化物 ,天然藥物以其中的有機物分子與微量元素間形成的配合物在動植物及人體的生命活動中發(fā)揮作用[5]。而許多實驗證實，中藥的有效成分在形成配合物后，生物活性增強。例如木犀草素與鋅離子配位后，抗DPPH自由基活性增強[6]，白花丹素與金屬離子配位后，抗癌活性增加[7]。大黃酸是一種含有α-酚羥基的蒽醌化合物，其中1，8 位羥基和9位羰基適于各種金屬離子配位。本文選擇錳[8]、鈷、鋅[9]等人體所必須的微量元素作為中心原子，合成大黃酸金屬配合物；采用紫外光譜法、紅外光譜法、核磁共振氫譜法等對配合物進行結(jié)構(gòu)表征；選用金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌等對配合物和配體進行抑菌活性測試，對比了配體和配合物的抑菌活性，篩選出抑菌活性最高的配合物。

圖1 大黃酸結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

菌種由成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

BRUKER AM-400型超導(dǎo)核磁共振儀； BRUKER Tensor-27型傅立葉變換中紅外光譜儀；UV-1700型紫外分光光度計；PHB-8型pH計；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，三洋電機株式會社）；雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺（SW-SJ-2D，中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司）；BP211D型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）。平板計數(shù)瓊脂PCA（生產(chǎn)批號：20120809，青島高科園海生物技術(shù)有限公司）；酵母粉（LP0021，LOT:1185342，生產(chǎn)廠家：o x o i d）；蛋白胨（L P O O 4 2，LOT:1094936，生產(chǎn)廠家：oxoid）。

1.2 配合物的合成

在裝有攪拌器和冷凝管的150 mL三口瓶中，加入1 mmol大黃酸的60 mL無水乙醇，攪拌,至大黃酸溶解后，加入0.5 mmol C4H6O4Zn．2H2O（醋酸鋅）的10 mL 無水乙醇醇溶液，逐滴加入氨水的乙醇溶液(1∶1，V∶V)，調(diào)節(jié)配體溶液的pH 值為8～10，繼續(xù)以反應(yīng)溫度為40℃攪拌反應(yīng)12 h, 將溶液靜置后真空抽濾, 依次用無水乙醇及乙醚將沉淀洗滌數(shù)次，真空干燥72 h，得粉末狀固體。以醋酸錳Mn（CH3COO)2．4H2O，醋酸鈷CH3COOCo．4H2O，替代醋酸鋅合成了大黃酸-鈷，大黃酸-錳配合物。

1.3 抑菌實驗

1.3.1 菌液制備 分別取試驗菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌）適量，以液體培養(yǎng)基15 mL（含蛋白胨10 g．L-1、酵母粉5 g．L-1、氯化鈉10 g．L-1，以0.1 mol．L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7-7.4）在培養(yǎng)皿中以37°C，5.0% CO2條件下培養(yǎng)24 h，得細菌混懸液，以無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為10-7CFU．mL-1，備用。

1.3.2 藥液制備 稱取一定量固體藥物，1 mg．mL-1溶于滅菌的二甲基亞砜溶劑中，以紫外照射滅菌8 h，并且以0.22 μm微孔濾膜過濾。臨用前將滅菌后的，直徑5 mm圓形濾紙片泡入藥液內(nèi)2 h，備用。

1.3.3 平皿實驗法 趁熱吸取滅菌后的平板計數(shù)瓊脂PCA液體在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15 mL，待其凝固后，吸取50 μL制備好的菌液均勻涂布于瓊脂表面，將含菌瓊脂培養(yǎng)基放入孵箱培養(yǎng)0.5 h后取出，再將含藥紙片平整地貼在含菌培養(yǎng)基上，在37°C，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。平行測定3次，取平均值[10]。

1.3.4 二倍稀釋法 稱取2 mg固體藥物，溶解于0.02 mol．L-1的氫氧化鈉溶液中，以稀鹽酸調(diào)整pH值為7～7.4，最后以ph7～7.4的超純水定容至10 mL。取滅菌小試管數(shù)支，在第一支試管中加入2 mL藥液和2 mL培養(yǎng)基，混勻后從第一支試管中取出2 mL混合液加入到第二支試管中，同時第二支試管中加入培養(yǎng)基2 mL，以此類推，每個化合物稀釋5個濃度，第6支試管中不加菌液作為空白對照組。各試管中分別加入菌液50 μL，在37°C，5%二氧化碳條件下孵化24 h觀察結(jié)果。以不生長細菌（即試管內(nèi)液體不渾濁）的最小濃度為MIC。平行測定3次，以2次以上結(jié)果相同為準。

2 實驗結(jié)果

2.1 配合物基本性質(zhì)

配合物與配體相比較，外觀顏色發(fā)生較大變化(大黃酸-鈷和大黃酸錳為紫紅色，大黃酸-鋅為桔黃色），三種金屬配合物均難溶于乙醚，氯仿，丙酮等有機試劑，但易溶解在dmso，dmf等堿性試劑中。配合物熔點較高，在400°C條件下仍然不分解。在900℃馬弗爐中灼燒數(shù)小時后可以得到金屬氧化物粉末。

2.2 配合物的紫外光譜

將大黃酸和大黃酸金屬配合物配制成5×10-5mol．L-1的無水甲醇溶液，在200～600 nm范圍內(nèi)進行UV全波長掃描得配體和配合物的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)(見表1)。大黃酸在229 nm的吸收帶屬于笨樣結(jié)構(gòu)，257 nm則屬于醌結(jié)構(gòu)，431 nm處吸收則屬于C=O鍵。而形成配合物后金屬離子和配體之間的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，π共軛離域體系增大，電子躍遷需要的能量下降，故配合物吸收峰發(fā)生紅移，但基本保持配體峰形。此外配合物均在517nm左右均出現(xiàn)一個新峰,可能原因是由于蒽醌結(jié)構(gòu)中C=O參與配位，該鍵上電子云密度變化造成。

表1 大黃酸及大黃酸金屬配合物的UV（nm）數(shù)據(jù)

2.3 配合物紅外光譜

配體以及配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)見表2，與大黃酸在3060 cm-1有較寬的羥基吸收帶，而配合物中此吸收減弱，說明α-羥基參與了配位，配合物在3250～3430 cm-1處出現(xiàn)寬的吸收峰，表明配合物中可能有結(jié)晶水存在。配體大黃酸1629 cm-1的吸收來自于可以和α-羥基形成氫鍵的羰基，即9位羰基；1692 cm-1屬于10位羰基[11]。相比配體，配合物9位C＝O吸收峰均發(fā)生紅移，原因是金屬離子通過9位羰基與α-羥基配位，羰基的雙鍵的伸縮力常數(shù)減小，電子云密度降低，從而使峰帶移向低波數(shù)區(qū)域。而參與配位的α-OH的碳氧鍵上，由于配位作用使金屬離子，羰基氧，羥基氧，蒽醌環(huán)上碳原子成環(huán)，引起共軛效應(yīng)，C-O鍵上電子云密度增加，故C-O的吸收峰紫移，進一步說明羰基和羥基參與配位。同時配合物均在510～520 cm-1之間產(chǎn)生了M-O，即金屬離子的伸縮振動吸收峰。

表2 大黃酸及大黃酸金屬配合物的IR(cm-1)數(shù)據(jù)

2.4 配合物的核磁共振氫譜

在氘代二甲基亞砜溶劑中測定了配體和配合物的核磁共振氫譜，配體和配合物峰形差別較大，結(jié)果見表3。大黃酸的羧基峰是δ13.73的一個鈍峰，δ11.89則屬于大黃酸的兩個羥基。蒽環(huán)上的氫則位于δ7～9之間。大黃酸鈷配合物在δ10.15～13.78(m,4H)出現(xiàn)一弱多重峰，此峰為羥基和羧基峰重合后形成。在δ7.29～8.07范圍內(nèi)出現(xiàn)單峰、重峰及多重峰，為蒽環(huán)上的氫；大黃酸錳配合物在δ12.18（m,4H)出現(xiàn)一弱多重峰，在7.00～8.50(m,10H）出現(xiàn)寬三重峰；大黃酸鋅在δ12.56(m,2H)出現(xiàn)弱多重峰，在δ6.3～8.8(m,10H）出現(xiàn)寬多重峰。3位羧基具有強的吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，因此1位羥基更容易解離，通過9位羰基與金屬離子形成配合物。

表3 大黃酸及大黃酸配合物的1H NMR的數(shù)據(jù)(DMSO)

綜合上述分析結(jié)果，大黃酸金屬配合物的可能組成為：兩分子大黃酸與一分子金屬離子通過基與1位羥基形成配合（見圖2）。

圖2 大黃酸金屬配合物可能結(jié)構(gòu)

2.5 濾紙片法實驗結(jié)果

大黃酸及大黃酸的配合物的dmso溶液均可以產(chǎn)生抑菌圈，結(jié)果見表4，大多數(shù)配合物的抑菌活性大于配體。抑菌圈大于20 mm為強抑菌作用，10-20 mm為中等抑菌強度，抑菌圈小于10 mm為弱抑菌作用[12]。由抑菌圈大小來看，大黃酸錳對于金黃色葡萄球菌(SA)以及大腸桿菌(E.coli)抑制作用最強，大黃酸鈷對于肺炎鏈球菌(s.pneumoniae)抑菌活性最強?？瞻椎膁mso對于三種細菌均未產(chǎn)生明顯的抑菌圈。

表4 抑菌實驗結(jié)果(抑菌圈直徑/mm，，n=3 )

表4 抑菌實驗結(jié)果(抑菌圈直徑/mm，，n=3 )

菌種 dmso 大黃酸 大黃酸-Mn 大黃酸-Co 大黃酸-Zn金黃色葡萄球菌 — 19.0±0.91 23.3±0.74 21.6±0.82 18.4±0.35大腸桿菌 — 16.5±0.50 20.5±0.66 19.5±0.48 16.5±0.69肺炎鏈球菌 — 18.2±0.85 20.7±0.92 22.5±0.33 19.0±0.70

2.6 二倍稀釋法測定結(jié)果

結(jié)果表明大黃酸和大黃酸金屬配合物對三種細菌均具有抑菌活性，其中大黃酸-錳和大黃酸-鈷對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強于配體大黃酸，MIC均達到12.5 μg．mL-1,小于大黃酸（25 μg．mL-1）；大黃酸金屬配合物對于大腸桿菌抑菌作用稍差，但MIC高于配體。大黃酸-錳對于肺炎鏈球菌抑菌活性最強，其MIC值達到6.025 μg．mL-1。

表5 二倍稀釋法實驗結(jié)果(MIC/μg．mL-1，n=3）

3 討論

本文以大黃中活性成分大黃酸為原料，合成了大黃酸-錳，大黃酸-鋅，大黃酸-鈷三種金屬配合物，采用紫外光譜法，紅外光譜法，核磁共振氫譜法等三種方法對配合物結(jié)構(gòu)進行了表征，確定了配合物可能的結(jié)構(gòu)組成。濾紙片法測試結(jié)果和二倍稀釋法測試結(jié)果大致吻合。抑菌活性測試結(jié)果說明，大多數(shù)配合物抑菌活性強于配體，初步證實了大黃酸與金屬離子具有協(xié)同抗菌作用。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

The study on inhibiting capacity of Rhein metal complex on bacteria

XIANG Hui, PAN Xiao-li, TAN Yu-zhu, WU Bing, LU Xiao-hua, DONG Xiao-ping//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:Synthesize three Rhein metal complex and represent the structure，then compare the in vitro inhibition of three bacteria.Method:The metal complexes were synthesized in absolute alcohol and UV spectrum，IR spectrum，NMR were used to represent the structure to identify the composition and construction. The MIC of complexes were detected using double dilution method, and the inhibiting capacity of metal complexes on Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia and colibacillary were tested by flter paper method.Result:Through the structural representation, the metal complex structure was confrmed to be consisted of two Rhein molecule and one metallic ion. By the method of flter paper，the inhibiting capacity on bacteria of the metal complex were better than ligand. Rhein-Mn showed the strongest inhibiting capacity on Staphylococcus aureus and Bacterium coli with inhibition zone of 23.3 mm and 20.5 mm respectively. The strongest inhibiting capacity on Streptococcus pneumoniae was found in Rhein-Co with inhibition zone of22.5 mm. The MIC of complexes detected using double dilution method showed that the inhibiting capacity of metal complexes were mostly stronger than the ligand.Conclusion:After Rhein and metallic ion formed metal complex，the inhibiting capacity are enhanced.

Rhein; flter paper method; double dilution method; metal complex;inhibiting capacity on bacteria

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-007-04

四川省教育廳資助項目（13ZB0302）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

向暉，在讀研究生 Email:xianghui12688@126.com

董小萍，教授，主要從事中藥質(zhì)量標準化研究Email:dongxiaoping11@126.com

2014-05-06