甘文婷 (綜述)，孫 新，陸 琰(審校)

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510623)

肺損傷是由物理性、化學(xué)性、藥物性、機(jī)械性和生物性等多種刺激因素引起的肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能形態(tài)異常，從而釋放大量的炎性介質(zhì)導(dǎo)致肺表面活性物質(zhì)降低，肺泡損傷、水腫，肺組織纖維化等病理改變，最終引起以呼吸困難為主要表現(xiàn)的臨床常見疾病[1-2]。機(jī)械通氣、糖皮質(zhì)激素、肺表面活性物質(zhì)替代等經(jīng)典治療方法，可在一定程度上改善肺損傷患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后，但缺乏特效的治療方法。隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展及肺損傷患者對(duì)預(yù)后及生活質(zhì)量要求的不斷提高，醫(yī)學(xué)工作者也在積極尋找新的治療方法改善患者預(yù)后，在一定程度上推動(dòng)了細(xì)胞治療在肺損傷方面的研究發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已陸續(xù)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可減輕脂多糖、博來霉素、大腸埃希菌內(nèi)毒素、支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)等引起的急慢性肺損傷[3-5]。并在活體中證明了BM-MSCs是通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮其有利作用的[6-7]。人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞亦同樣具有減輕高氧導(dǎo)致的新生小鼠肺損傷引起的BPD[8-10]。繼間充質(zhì)干細(xì)胞之后，近幾年關(guān)注度不斷升高的人羊膜上皮細(xì)胞(human amnion epithelial cells，hAECs)在減輕肺損傷的作用及其機(jī)制等方面的研究,也取得了一定進(jìn)展。

1 hAECs的特點(diǎn)及其運(yùn)用價(jià)值

hAECs是人羊膜細(xì)胞的組成部分[11]。人羊膜細(xì)胞來源于孕婦分娩后廢棄胎盤上的羊膜組織，是由受精卵發(fā)育至第8日的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化而來的，由hAECs和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞兩種細(xì)胞構(gòu)成，保有最早的胚胎干細(xì)胞特性，具備向三個(gè)胚層組織分化的能力[12-13]。hAECs與BM-MSCs、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大多數(shù)表面抗原相似，CD29、CD73、CD105、CD90、CD44及多能性干細(xì)胞表面標(biāo)志Oct4、Nanog均陽性表達(dá)，而CD14、CD34、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)志及人類白細(xì)胞DR抗原均陰性表達(dá)[14-15]。其中hAECs還表達(dá)胚胎干細(xì)胞全能性表面標(biāo)志SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81，這些均是保持胚胎未分化性能及維持全能分化潛能的重要標(biāo)志性因子[11]。然而,hAECs雖具有干細(xì)胞特性，但從本質(zhì)上來說并不屬于干細(xì)胞，因?yàn)樗荒軣o限生長(zhǎng)，只是一類具有干細(xì)胞特性的上皮細(xì)胞，且其生物學(xué)特性與孕婦所處的孕期相關(guān)[16]。

近期有研究提出已在體外建立了無限增殖的hAECs，以期將其更好地用于疾病的治療[17]。典型的hAECs一般為圓形或橢圓形，可呈鋪路石樣生長(zhǎng)，且表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志角蛋白19，不表達(dá)波形蛋白。hAECs、BM-MSCs及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的干細(xì)胞特性，相比人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，hAECs尚無顯著優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于BM-MSCs需通過有創(chuàng)途徑獲得，且隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量顯著下降，分化能力降低，hAECs有來源豐富等眾多優(yōu)越性，因此其在肺損傷的運(yùn)用價(jià)值將更加廣闊。

2 hAECs減輕肺損傷的作用及其機(jī)制

隨著hAECs的各種干細(xì)胞特性及眾多優(yōu)越性逐漸得到證實(shí)，其在治療肺損傷方面的研究日益增多，目前研究較多的為其在各種肺損傷中的作用及其機(jī)制。

2.1hAECs減輕肺損傷的作用及可能影響因素 2009年Cargnoni等[18]研究同種異體羊膜細(xì)胞及異種羊膜細(xì)胞(人羊膜細(xì)胞)在博來霉素所致C57BL/6小鼠肺損傷中的作用，提出無論是同種異體還是異種羊膜細(xì)胞均能減緩博來霉素引起的肺部炎癥及纖維化，兩者無顯著差異，從而提出人羊膜細(xì)胞具有干細(xì)胞特性及減輕肺損傷的作用。2010年Moodley等[19]通過研究經(jīng)靜脈移植hAECs對(duì)博來霉素所致免疫功能缺陷小鼠肺損傷的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)hAECs通過減少肺內(nèi)炎性因子,如白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子β等釋放、膠原沉積，表達(dá)Ⅱ型肺泡細(xì)胞表型等作用減輕肺部炎癥及纖維化,并促進(jìn)肺損傷的修復(fù)，與其他干細(xì)胞來源的實(shí)驗(yàn)研究相比，本實(shí)驗(yàn)的移植成活率較高，從而提出干細(xì)胞移植存活率可能受導(dǎo)致肺損傷的原因、給藥方式、干細(xì)胞類型及實(shí)驗(yàn)研究所用的免疫功能缺陷小鼠的影響。

2011年Murphy等[20]進(jìn)一步研究證實(shí),hAECs對(duì)博來霉素所致免疫功能正常小鼠的肺損傷也具有同樣的保護(hù)作用，更加突出了hAECs低免疫原性的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)觀察到hAECs主要通過抑制腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等炎性因子減輕肺部炎癥及纖維化而其調(diào)節(jié)功能很可能受到機(jī)體對(duì)損害反應(yīng)的影響，且進(jìn)一步研究單獨(dú)使用人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在肺損傷中的作用十分必要。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未受到博來霉素作用的免疫功能正常小鼠使用hAECs會(huì)引起一定程度的肺部炎癥，而該作用對(duì)正常肺部是否存在潛在的不良影響尚需深入研究，因?yàn)檫@與hAECs是否能運(yùn)用于無肺損傷個(gè)體的預(yù)防性治療密切相關(guān)[18，20]。同年Vosdoganes等[21]發(fā)現(xiàn)hAECs通過宮內(nèi)移植，具有與在博來霉素所致小鼠肺損傷中相似的免疫調(diào)節(jié)作用，能減輕脂多糖引起的胎羊肺損傷，但不能阻止其引起的肺發(fā)育的改變。

2012年Murphy等[22]在之前研究結(jié)論的基礎(chǔ)上報(bào)道，對(duì)比hAECs在博來霉素所致表面蛋白C正常(Sftpc+/+)和表面蛋白C缺失(Sftpc-/-)的小鼠肺損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)hAECs在(Sftpc+/+)小鼠中具有和之前研究中一致的減輕肺損傷的作用，而(Sftpc-/-)小鼠的肺損傷無任何改善，(Sftpc-/-)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能受損，這似乎提示hAECs對(duì)肺損傷的修復(fù)作用與宿主巨噬細(xì)胞功能是否正常有關(guān)。同年Hodges等[23]報(bào)道，宮內(nèi)hAECs移植可減輕宮內(nèi)胎羊機(jī)械通氣所致的肺損傷。近期Vosdoganes等[24]進(jìn)一步報(bào)道,hAECs可改善高氧導(dǎo)致的新生小鼠肺損傷引起的類似BPD的肺組織改變和對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，并且正常對(duì)照組予以hAECs不會(huì)引起肺組織損害，與hAECs在脂多糖、博來霉素等引起的肺損傷中的作用相比，hAECs在該研究中改善肺損傷的作用較小，這可能與hAECs移植方式、移植的時(shí)間及損傷因素作用于肺組織的時(shí)間有關(guān)。

2.2人羊膜上皮細(xì)胞減輕肺損傷的機(jī)制 hAECs可減輕脂多糖、博來霉素、高氧等因素引起的肺損傷已得到證實(shí)，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。Cargnoni等[18]提出hAECs移植后在骨髓、腦、肺組織等臟器中均有定植，但其減輕肺損傷的作用機(jī)制可能是通過生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的旁分泌作用。細(xì)胞本身是否可分化修復(fù)肺組織尚不清楚，近些年相關(guān)機(jī)制的研究陸續(xù)增多。Moodley等[19]發(fā)現(xiàn),hAECs移植到肺損傷的小鼠中可表達(dá)肺組織相關(guān)標(biāo)志甲狀腺素轉(zhuǎn)錄因子，而該因子為肺早期發(fā)育的標(biāo)志是氣管形成和Ⅱ型肺泡細(xì)胞形成的關(guān)鍵性因素。Murphy等[20]提出,在目前的研究中仍然沒有合理證據(jù)證明在肺損傷的活體組織中保留有意義數(shù)量的活性hAECs，減輕肺損傷作用的大小似乎與hAECs是否在肺中定植及其多少無顯著正相關(guān)。

在隨后Tan等[25]研究小組成員的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn),hAECs不僅通過減少小鼠肺部巨噬細(xì)胞的遷移使得巨噬細(xì)胞釋放減少達(dá)到減輕肺損傷的作用，而且可促進(jìn)肺泡中巨噬細(xì)胞表型由主要的炎癥型M1轉(zhuǎn)化為修復(fù)型M2，這點(diǎn)在Ionescu等[6]對(duì)比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液與BM-MSCs對(duì)肺損傷的作用機(jī)制研究中也有提及。并提出這些影響至少部分與hAECs釋放的可溶性因子有關(guān)，而與細(xì)胞間的相互作用無關(guān)聯(lián)，從而進(jìn)一步證實(shí)hAECs對(duì)肺損傷的修復(fù)作用主要通過免疫調(diào)節(jié)，而不是hAECs在肺中的定植。同年Vosdoganes等[21]通過宮內(nèi)移植hAECs實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了甲狀腺素轉(zhuǎn)錄因子的存在，通過觀察到的與Murphy等[20]研究相似的低移植率提出，hAECs對(duì)肺損傷的各種調(diào)節(jié)作用很可能是通過免疫調(diào)節(jié)而不是移植成活率。并首次用數(shù)據(jù)證實(shí)hAECs在胎羊中具有促進(jìn)表面活性蛋白生成的能力，而這些活性蛋白對(duì)維持肺組織結(jié)構(gòu)、減輕肺部炎癥均有一定作用。Murphy等[22]進(jìn)一步研究hAECs在肺損傷中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了其他研究中提及的表面活性蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出表面活性蛋白在減輕肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。然而,該研究未觀察到其他實(shí)驗(yàn)中提及的hAECs可在肺中定植及分化為肺上皮細(xì)胞[18]。

Hodges等[23]證實(shí)hAECs減輕肺損傷過程中表面活性蛋白SP-C的存在，提出hAECs在活體內(nèi)可分化為肺泡細(xì)胞，這點(diǎn)結(jié)論與其他研究有所不同，然而該實(shí)驗(yàn)存在很多局限性，胎內(nèi)機(jī)械通氣所致的肺損傷在臨床新生胎兒中不存在、樣本量小，該作用在大樣本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中是否存在需進(jìn)一步研究。hAECs具有與BM-MSCs同樣的減輕肺損傷的作用，目前許多研究均認(rèn)為hAECs對(duì)肺損傷的修復(fù)作用是通過免疫調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，但具體的作用機(jī)制尚不清楚，BM-MSCs與hAECs在治療肺損傷作用機(jī)制中有何異同尚需繼續(xù)考究。

3 人羊膜上皮細(xì)胞臨床應(yīng)用前景

目前hAECs的臨床前研究已涉及各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在不同原因所致急、慢性肺損傷方面的研究也日益增多，其中最受期待的莫過于在BPD中的運(yùn)用。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，胎齡<30周的低出生體質(zhì)量乃至極低出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒的存活率逐漸增高，早產(chǎn)出生及生后長(zhǎng)時(shí)間和高濃度吸氧容易引起肺部炎癥及纖維化，而這些均是引起B(yǎng)PD高危因素，使得早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率逐漸升高，是重要的致死和致殘性疾病[2]。傳統(tǒng)的治療方法以激素治療為主，有研究報(bào)道激素治療BPD可導(dǎo)致肺泡壁厚度增加，對(duì)肺組織有不同程度的不利影響[26]。

目前，BM-MSCs、hAECs可減輕高氧所致的新生小鼠肺損傷在臨床前研究中已得到證實(shí)，基于hAECs眾多優(yōu)越性，若能將其運(yùn)用于新生兒高氧肺損傷的臨床治療中，那將大大降低新生兒BPD的發(fā)生率，對(duì)減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)及提高早產(chǎn)兒的生活質(zhì)量均有重大意義。hAECs具有向三個(gè)胚層分化的能力，除了在肺損傷方面的作用，hAECs在治療糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)耳等多個(gè)組織器官病變的臨床前研究也取得了一定進(jìn)展，若能成功運(yùn)用于臨床，hAECs在各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的作用將不可估量。近期有研究提出，間充質(zhì)干細(xì)胞在肺中的少量定植對(duì)肺損傷的長(zhǎng)期修復(fù)可能發(fā)揮重要作用，且移植的時(shí)間與修復(fù)作用的程度也密切相關(guān)[9，27]。因此,對(duì)于一些研究中觀察到的定植于肺組織中的無意義數(shù)量的hAECs,在肺損傷中是否發(fā)揮作用及高氧肺損傷中hAECs的最佳移植時(shí)間、移植方式、移植劑量及運(yùn)用于治療時(shí)三者最佳的搭配方式等的研究意義重大。目前對(duì)于分離、消化、提取、純化hAECs尚無統(tǒng)一的方法，hAECs中不可避免混雜有少量的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)于不同研究組觀察到的hAECs移植后是否定植于肺組織中截然相反的結(jié)論，該現(xiàn)象的出現(xiàn)是否與可能混雜的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞有關(guān)，在hAECs減輕肺損傷的作用中會(huì)不會(huì)存在人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞協(xié)同或單獨(dú)發(fā)揮作用尚不清楚。隨著科技的進(jìn)步，相信關(guān)于hAECs運(yùn)用于肺損傷治療的眾多疑惑將逐一解決，在不久的將來hAECs移植可成為臨床可行的減輕肺部炎癥及預(yù)防BPD的有效治療方法。

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