劉 杰，趙滿倉，周海峰

(北京軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，北京100700)

檢驗科細菌室室間質(zhì)評是評價實驗室水平的重要手段，選用合適的細菌鑒定系統(tǒng)是提高室間質(zhì)評成績的保證。近年來隨著自動微生物檢測技術(shù)的迅速發(fā)展[1]，各級醫(yī)院逐步將VITEK系列應(yīng)用于細菌室的鑒定和藥物敏感性試驗[2]。VITEK-Ⅱ是一種由電腦控制的全自動微生物鑒定系統(tǒng)，它能分別或同時完成臨床微生物的鑒定和藥物敏感性試驗等。本室將北京檢驗中心發(fā)放的76株質(zhì)控菌用VITEK-Ⅱ與傳統(tǒng)手工法API進行對照鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及套試劑 VITEK-Ⅱ全自動微生物分析儀及鑒定卡，API微生物鑒定條及配套試劑均購自法國梅里埃生物公司。羊血瓊脂平板、伊紅美藍平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、沙保羅瓊脂平板購自英國OXOID公司。

1.1.2 室內(nèi)質(zhì)控菌株 美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)質(zhì)控菌株大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、白色念珠菌(ATCC90028)購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 診斷血清 沙門菌屬診斷血清，志賀菌屬診斷血清，腸道致病性大腸埃希菌診斷血清，均由蘭州生物制品研究所生產(chǎn);腸道侵襲性、產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清，由成都生物制品研究所生產(chǎn)。

1.1.4 室間菌株 北京市檢驗中心發(fā)放的2008年3月至2012年10月質(zhì)控菌共75個標(biāo)本76株質(zhì)控菌(其中菌株批號為2011-3-A2的為兩種細菌的混合菌標(biāo)本)。其中45株革蘭陰性桿菌，包括腸桿菌科細菌29株，非發(fā)酵菌14株，弧菌科1株，博德特菌屬1株;18株革蘭陽性球菌，包括葡萄球菌8株，腸球菌3株，鏈球菌6株，片球菌屬1株;7株真菌;6株其他細菌，包括厭氧菌3株，革蘭陽性桿菌3株。

1.2 方法

1.2.1 菌種準備 ①凍干ATCC菌株:在凍干菌種管中加入0.2 mL新鮮牛肉湯或無菌小牛血清，充分搖勻，分別接種于血瓊脂、伊紅美藍平板、SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板(置于35.0℃)、沙保培養(yǎng)基(置于30.0℃)孵育24～28 h。②平板培養(yǎng)基菌株:根據(jù)標(biāo)本來源，如血、尿、膿、分泌物直接挑取單個菌落接種在羊血瓊脂平板、伊紅美藍平板、沙保羅瓊脂上。大便標(biāo)本接種在SS瓊脂平板、伊紅美藍平板、沙保羅瓊脂上，35℃下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 鑒定方法 ①傳統(tǒng)API方法:根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色接種相應(yīng)的API微生物鑒定條。②VITEK-Ⅱ鑒定法:按VITEK-Ⅱ儀器說明書，根據(jù)革蘭染色，配制成一定濃度的細菌懸液，分別填充GP等鑒定卡，然后上機封口進行培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定結(jié)果準確性判斷 API和VITEK-Ⅱ用鑒定百比率(%Id，概率，指示出不同菌類的比較)和T值(Tindex，指示出在同一個菌類的相似程度)表示生化結(jié)果組合與資料庫內(nèi)的典型條目(Taxa)做出比較，來指示檢測可信度的評價。依據(jù)T值及%Id的組合，做出評語:ⅠExcellent Identification%Id＞99.9及 T ＞0.75;ⅡVery good Identification%Id＞99.0及 T＞0.50;ⅢGood Identification%Id＞90.9 及 T ＞0.25;ⅣAcceptable Identification%Id＞80.0及T＞0;ⅤDoubtful profile出現(xiàn)如果，則其中一個測試非常違反典型生化結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩種方法所有鑒定的準確度均為“Good Identification”以上，甚至為“Excellent Identification”。

2.1 45株革蘭陰性桿菌鑒定結(jié)果 API系列腸桿菌科接種API 20E，非發(fā)酵細菌接種非發(fā)酵API 20NE，18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GN卡，3～10 h完成鑒定。其中2011-3-A2為大腸埃希菌/糞腸球菌混合菌、2008-2-A5為大腸埃希菌(ATCC35218)、2012-2-A5為肺炎克雷伯菌(ATCC1706)、2012-1-A5為肺炎克雷伯菌(ATCC1705 KPC陽性)、2012-1-A3為陰溝腸桿菌(ATCC700323)。而沙門菌屬、志賀菌屬以及菌株批號為2009-1-A3的致病大腸埃希菌O111:K58需要用血清學(xué)凝集試驗確認，不視為鑒定錯誤。腦膜炎敗血伊麗莎白菌，曾稱腦膜炎敗血黃桿菌或腦膜炎敗血金黃桿，不視為鑒定錯誤。對革蘭陰性桿菌的鑒定結(jié)果，VITEK-32準確42株，API準確44株。

2.2 18株革蘭陽性球菌的鑒定結(jié)果 API系列葡萄球菌接種API STAPE，鏈球菌接種 API STREP，18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GP卡，3～8 h完成鑒定，其中 2012-2-A4為金黃色葡萄球菌(ATCC25923)(MSSA)、2012-1-A4為金黃色葡萄球菌(ATCC43300)(MRSA)、2011-3-A2為大腸埃希菌/糞腸球菌混合菌。有2株鏈球菌名稱不符的細菌(2009-3-A2和2011-1-A2)，但為同一菌屬，即牛鏈球菌復(fù)合群，API鑒定結(jié)果有一次錯誤，VITEK-Ⅱ無錯誤。

2.3 7株酵母類真菌的鑒定結(jié)果 API系列酵母菌及念珠菌接種API 20 C AUX，24～48 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用YST卡，18 h完成鑒定，其中2010-3-A5為克柔假絲酵母菌(ATCC6528)。API和VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果均無錯誤。

2.4 6株其他細菌的鑒定結(jié)果 API系列厭氧菌接種API 20 A，24～48 h完成鑒定。李斯特菌接種API Listeria、棒狀桿菌屬接種API Coryne、芽胞菌接種API 50CHB，均為18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GP卡(李斯特菌)，3～8 h完成鑒定、ANC卡(厭氧菌-棒狀桿菌)6 h完成鑒定、BCL卡(需氧芽孢桿菌)14 h完成鑒定，API和 VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果均有一次錯誤。

2.5 VITEK-Ⅱ與API鑒定率的比較 API的總鑒定率大于VITEK-Ⅱ(96.0%vs 94.7%)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.935，P ＞0.05)。其中 API鑒定革蘭陰性桿菌的鑒定率大于VITEK-Ⅱ(97.8%vs 93.3%)，而 API鑒定革蘭陽性球菌的鑒定率小于VITEK-Ⅱ(94.4%vs 100%)，其余均一致(表5)。

3 討論

1970年，法國梅里埃推出API微生物鑒定條成為細菌鑒定的國際金標(biāo)準，是一種國際公認的細菌鑒定手工檢索編碼[4]。API是目前涵蓋范圍最廣的細菌鑒定系列，但API畢竟是一個手工系統(tǒng)，因此梅里埃公司又研發(fā)了全自動微生物鑒測儀VITEK-Ⅱ。

3.1 VITEK-Ⅱ的優(yōu)點 本研究結(jié)果可見，VITEK-Ⅱ在鑒定正確的數(shù)量上雖然較API少一株，但顯然VITEK-Ⅱ更加簡化且耗時短。因為VITEK-Ⅱ鑒定儀與傳統(tǒng)鑒定法比較，功能多、速度快、無需附加試劑，每個試驗卡有60個培養(yǎng)小孔，結(jié)果更準確，可鑒定超過98%的臨床常見菌株，超過2000個對照表型和20000個最小抑菌濃度分布。

3.2 在質(zhì)控菌鑒定中存在的問題 沙門菌與志賀菌屬的菌株均需血清分型與證實。而API將一株腸炎沙門菌誤檢為傷寒沙門菌，但經(jīng)血清分型修正錯誤。2011-2-A3的莫拉菌屬由于是革蘭陰性球桿菌，菌體小，革蘭染色不易脫色，常成雙或短鏈狀排列，類似奈瑟菌，容易染成革蘭陽性球菌，而VITEK-Ⅱ誤用 GP鑒定卡誤報產(chǎn)單核李斯特菌。VITEK-Ⅱ?qū)?011-2-A2的腦膜敗血伊莉莎白菌(原名腦膜炎膿毒黃桿菌)誤鑒定成少動鞘氨醇單胞菌;將2008-3-A2支氣管炎博德特菌(與百日咳博德特菌同屬)誤鑒定成木糖氧化無色桿菌，原因不明。由于API系列數(shù)據(jù)庫內(nèi)沒有片球菌屬[5]的分類資料，無法鑒定，誤鑒定為乳球菌屬。2011-2-A1的需氧芽孢桿菌，兩種方法均誤鑒定成李斯特菌，是因為該質(zhì)控菌革蘭染色為陽性桿菌，未見到芽孢，因此均錯。對臨床上較少見的致病菌，如弧菌屬、棒狀桿菌屬、真菌等均獲正確鑒定。有2株鏈球菌名稱不符的細菌，但為同一菌屬，即牛鏈球菌復(fù)合群，因為“牛鏈球菌/馬腸鏈球菌復(fù)合群內(nèi)有7個種和亞種，即馬腸鏈球菌、解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種、嬰兒鏈球菌結(jié)腸亞種和不解乳鏈球菌”[3]。

3.3 原因分析及對策 要保證在細菌室間質(zhì)評中的獲得好成績，首先必須做好室內(nèi)質(zhì)量控制的各項工作:①待檢菌株必須是純培養(yǎng)。②正確觀察細菌溶血情況和氧化酶、觸酶、凝固酶試驗，必須規(guī)范判斷正確，否則會出錯誤結(jié)果。③革蘭染色的觀察必須準確無誤，選擇鑒定卡要慎重，必要時可通過多代培養(yǎng)、反復(fù)染色、加拉絲試驗等，再行鑒定，否則有可能產(chǎn)生鑒定導(dǎo)向的錯誤。④受檢菌株的菌齡應(yīng)在對數(shù)生長期，凍干保存的菌株，最好能轉(zhuǎn)種1～2代后，再行鑒定，準確率較高。⑤注意上機操作的全過程(包括準備細菌懸液、充填切割、上機的各個環(huán)節(jié))最好連續(xù)進行，不能久置耽擱，以免影響結(jié)果。其他注意事項:①操作過程中的污染(混懸液、吸頭、加樣槍)。②試劑過期及卡片本身問題，如部分管路堵塞。造成某些生化孔未能充入菌液，造成假陰性。③讀數(shù)儀光學(xué)讀數(shù)頭出現(xiàn)問題，光學(xué)系統(tǒng)需要經(jīng)常校正。

3.4 使用API系統(tǒng)的問題 有時新鮮培養(yǎng)的純培養(yǎng)細菌，鑒定結(jié)果卻不好，常見原因是附加試劑過期失效。附加試劑啟用后有效期僅1個月。尤其是FB試劑，顏色變深后應(yīng)棄去。此外即試劑過期。對此有以下建議:①在用VITEK-Ⅱ鑒定質(zhì)控菌時最好同時加上API系列，如兩種方法結(jié)果不相同，需要分析原因。②有時同一份細菌標(biāo)本在API與VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果的細菌名稱不同。首先確認其英文名稱是否一致。如果一致，則是一致結(jié)果。如果不一致，請復(fù)查。③有的菌株可出現(xiàn)“不能鑒定”，這種情況的原因需要進一步探討，結(jié)合API和傳統(tǒng)的雙歧索引法，以做出正確判斷，不能報出種名的細菌可以報該菌的屬名。④對VITEK-Ⅱ數(shù)據(jù)庫內(nèi)無資料而不能鑒定的菌株，應(yīng)同時采用其他廠家的鑒定方法，相互查缺補漏，以便順利完成鑒定。⑤應(yīng)及時更新數(shù)據(jù)庫。

綜上所述，要得到正確的鑒定結(jié)果，檢驗人員應(yīng)加強微生物基礎(chǔ)知識、手工鑒定基礎(chǔ)和操作技能的培訓(xùn)，加強學(xué)習(xí)儀器原理，同時作好室內(nèi)質(zhì)控工作的經(jīng)驗也很重要的，才能迅速、準確地為臨床提供可靠的診斷和治療依據(jù)。

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