池愛平，康琛喆，郭歡歡，李 虹，王一民，郭 飛

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

敗醬草多糖的組成及抗疲勞與耐缺氧作用

池愛平，康琛喆，郭歡歡，李 虹，王一民，郭 飛

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

目 的：評價敗醬草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）抗疲勞和耐缺氧的活性。方法：采用水提醇沉法提取HPP，對其基本成分組成進(jìn)行測定；同時建立小鼠負(fù)重游泳模型和耐缺氧模型，同時給予小鼠不同劑量的HPP水溶液，測定小鼠力竭游泳時間與耐缺氧時間以及血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮的濃度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性、肝糖原和肌糖原的含量。結(jié)果：HPP是一種含蛋白質(zhì)的多糖，蛋白質(zhì)含量為13.26%，單糖主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖以物質(zhì)的量比0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27組成；服用HPP可使小鼠游泳力竭時間顯著延 長、肝糖原含量升高，而BLA含量和CK活性均不同程度下降，但耐缺氧時間變化不明顯。結(jié)論：HPP具有抗疲勞的作用，但其對小鼠的耐缺氧作用不明顯。

敗醬草多糖；力竭運動；疲勞；缺氧

通過有針對性地補(bǔ)充外源性營養(yǎng)補(bǔ)劑或藥物活性成分來延緩或緩解運動員運動疲勞的發(fā)生，是解決運動性疲勞的有效途徑之一。研究表明，許多植物多糖成分具有改善運動性疲勞的作用[1-3]，其作用機(jī)制大多與提高機(jī)體糖儲備以及提高機(jī)體免疫能力等方面有關(guān)，故多糖抗運動性疲勞方面的研究成為近幾年運動營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。敗醬草是屬于敗醬科的一種草本植物，具有清熱解毒的作用，在我國各地均有生長，此外敗醬草還含有豐富的營養(yǎng)素，在許多地方被作為野生蔬菜食用[4-5]。近幾年的研究表明，敗醬草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）具有抗呼吸道合胞病毒[6]、抗宮頸癌[7]和抗氧化[8]等藥理活性。目前還未檢索到有關(guān)于HPP的抗疲勞與耐缺氧方面的研究，因此本實驗對陜西產(chǎn)敗醬草的多糖成分進(jìn)行提取，建立小鼠負(fù)重游泳模型與耐缺氧模型，通過灌胃小鼠HPP來評估其抗疲勞與耐缺氧的效果。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物為健康昆明種雄性小鼠，兩月齡，體質(zhì)量22～26 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物飼養(yǎng)中心。

敗醬草購于西安市吳家墳中藥店，粉碎后備用。

D-甘露糖（D-mannose，D-Man）、D-核糖（D-ribose，D-Rib）、L-鼠李糖（L-rhamnose monohydrate，L-Rha）、D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，D-GlcUA）、D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，D-GalUA）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-木糖（D-Xylose，D-Xyl）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、L-阿拉伯糖（L-arabinose，L-Ara）、D-巖藻糖（D-fucose，D-Fuc） 美國Sigma公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 北京化學(xué)試劑公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Honeywell公司；透析袋（MW10 000） 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752B型分光光度計 上海第三分析儀器廠；DD5低溫高速離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Christ A LPHA 1-4冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；紫外-可見分光光度計 上海分析儀器廠；Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀、Shimadzu Class-VP 6.1色譜工作站 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 HPP的提取工藝

干燥敗醬草皮→粉碎→80%的乙醇浸泡30 min→濾渣水提（料液比1∶15（m/V）、溫度80 ℃、時間2 h、提取次數(shù)2 次）→過濾→Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)→透析袋對水透析24 h→濃縮→終體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌→冷凍干 燥→HPP

1.3.2 HPP的組成測定

多糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[9]；糖醛酸含量測定采用硫酸-咔唑法[10]；蛋白質(zhì)含量測定采用雙縮脲法[11]。紫外光譜采集：稱取HPP 5 mg，配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸餾水為對照，在紫外光譜儀190～600 nm波長區(qū)域掃描。

單糖組成分析[12-13]：采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。取HPP 20 mg，置于具塞試管中，加水1 mL，加熱溶解后加入0.2 mol/L的TFA 1 mL，放入烘箱中，110 ℃水解8 h，冷卻至室溫，加0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為7，將水解液用重蒸水稀釋至10 mL，轉(zhuǎn)移到量瓶中，待測。對照液制備：分別稱取適量D-Man、D-Rib、L-Rha、D-GlcUA、D-GalUA、D-Glc、D-Xyl、D-Gal、L-Ara、D-Fuc，用10%甲醇配成0.1 mol/L的溶液。各取100 μL樣品液與對照液，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL、0.3mol/L NaOH溶液300 μL，70 ℃水浴60 min后冷卻至室溫，用0.3 mol/L鹽酸溶液300 μL中和，加入氯仿1.0 mL萃取，振蕩、離心，棄去下層液，重復(fù)3 次，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液10 μL準(zhǔn)備上樣。采用梯度洗脫方式。流動相A液為純乙腈；B液由0.45 g KH2PO4、0.5 mL TFA、100 mL乙腈和900 mL超純水組成（pH 7.5）。色譜柱：Venusil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梯度洗脫：0 min，94% B液；4 min，94% B液；5 min，88% B液；30 min，88% B液；進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為35 ℃。

1.3.3 抗疲勞實驗

小鼠隨機(jī)分為3 組（每組30 只）：對照組、HPP低劑量（100 mg/（kg·d））組和HPP高劑量（200 mg/（kg·d））組。HPP低、高劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量的多糖水溶液，對照組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 周。末次給藥30 min后，從各組中隨機(jī)取出10 只小鼠進(jìn)行負(fù)重（體質(zhì)量5%）游泳實驗，水溫28 ℃，記錄各組小鼠游泳力竭時間（力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)：小鼠頭部沉入水中5 s不能浮出水面）。小鼠力竭后立刻采血取材，測定血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的濃度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性。同時在各組剩余小鼠中隨機(jī)選擇10 只，不參與力竭游泳，直接麻醉取材，測定肝糖原與肌糖原含量。均使用南京建成生物制劑公司的試劑盒測定。

1.3.4 耐缺氧實驗方法

參照文獻(xiàn)[14]方法，對各組剩下的10 只小鼠進(jìn)行耐缺氧實驗。準(zhǔn)備帶塞的廣口瓶若干，每瓶加入5 g的鈉石灰，每瓶放入1 只小鼠，用凡士林涂抹瓶塞和瓶口，密閉，計時，直至小鼠呼吸停止，記錄小鼠的存活時間。

1.3.5 延長率的計算

按照下式計算抗疲勞實驗和耐缺氧實驗時間的延長率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPP的組成

采用水提醇沉法從1 000 g敗醬草原料中提取出HPP 25.4 g，得率為2.54%。蒽酮-硫酸法測定多糖含量為58.85%，D-GalUA含量為35.20%，雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量為13.26%；紫外光譜圖（圖1）顯示HPP在280 nm波長左右有強(qiáng)吸收峰，表明其確實含有結(jié)合蛋白，屬于蛋白多糖。HPP的HPLC色譜圖（圖2）顯示：HPP主要含有D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara，其物質(zhì)的量比依次為0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27。

圖1 HPP的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrum of HPP

圖2 HPP的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of HPP

2.2 小鼠力竭游泳時間與耐缺氧時間的測定結(jié)果

表1 各組小鼠力竭游泳時間與耐缺氧時間的對比（n＝1100）Table1 Comparison of swimming time until exhaustion and hypoxia resistance time of mice ((n = 1100))

如表1所示，與對照組相比，HPP低、高兩個劑量組小鼠力竭時間顯著延長（P＜0.05），延長率分別為23.95%和25.06%。然而HPP低、高劑量組小鼠耐缺氧時間與對照組相比較沒有顯著性差異，延長率較低（0.78%與2.22%）。結(jié)果表明，敗醬草多糖對小鼠抗疲勞的作用明顯，而對小鼠耐缺氧作用不顯著。

2.3 各組小鼠疲勞相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果

表2 各組小鼠疲勞相關(guān)指標(biāo)的比較（n＝1100）Table2 Comparison of fatigue-related biochemical parameters of mice (n = 1100))

如表2所示，與對照組相比較，HPP低、高兩個劑量組小鼠的力竭后CK活性與BLA濃度顯著降低，而HPP高劑量組小鼠的肝糖原含量顯著升高，但BUN濃度與肌糖原含量變化不明顯。上述結(jié)果說明，敗醬草多糖能夠增加小鼠肝糖原儲備，減少運動時的乳酸生成，改善力竭運動造成的小鼠肌組織損傷程度。

3 結(jié)論與討論

本實驗采用水提醇沉法對敗醬草多糖進(jìn)行提取，多糖得率為2.54%，含量為58.85%，D-GalUA含量為35.20%。在提取過程中已經(jīng)對游離蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，但紫外光譜結(jié)果顯示敗醬草多糖含有結(jié)合蛋白，經(jīng)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量為13.26%，因此HPP是一種蛋白多糖。HPLC色譜圖結(jié)果顯示，HPP的單糖組成主要是：D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara（物質(zhì)的量比依次為0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27）。

游泳力竭模型是常用的一種小鼠運動疲勞模型[15-16]。本實驗通過5 周的小鼠游泳模型來評價敗醬草多糖的抗疲勞作用，測定指標(biāo)選擇與糖原儲備、糖代謝相關(guān)的指標(biāo)。肝糖原與肌糖原是耐力運動的主要能量來源，雖然本實驗檢測到力竭前各組小鼠肌糖原含量無顯著差異，但HPP高劑量組小鼠的肝糖原儲備明顯高于對照組，說明HPP能夠提高機(jī)體糖原儲備，這是其延緩力竭游泳時間的主要原因之一。BLA是反映機(jī)體糖無氧代謝的一個重要指標(biāo)[17]。本實驗說明，敗醬草多糖能夠提高機(jī)體糖的有氧代謝能力，降低糖的無氧代謝參與程度，這是敗醬草多糖延緩小鼠運動疲勞的另一個原因。目前不少研究證實，植物多糖可以通過改善機(jī)體糖代謝系統(tǒng)來達(dá)到抗疲勞的作用[18-20]。BUN反映蛋白質(zhì)參與代謝的程度，也是檢測運動性疲勞的另一個理想指標(biāo)[21]，機(jī)體對運動負(fù)荷適應(yīng)能力越差，不僅糖的無氧代謝參與程度增加，而且蛋白質(zhì)的分解代謝的程度也會有不同程度的增加，但本實驗結(jié)果表明，敗醬草多糖對于蛋白質(zhì)的分解代謝影響不明顯。血清CK活性的變化是評定骨骼肌微細(xì)損 傷的一個重要生理指標(biāo)[22]。過度運動會使機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度加大，對肌組織造成一定的損傷[23-24]。本實驗結(jié)果表明，敗醬草多糖可以降低游泳小鼠血清CK活性，這可能與敗醬草多糖的抗氧化性有關(guān)[8]。關(guān)于多糖對于小鼠耐缺氧能力的影響，已有研究證明其效果顯著[14,25-27]，但本實驗結(jié)果表明，敗醬草多糖此作用并不明顯。耐缺氧能力由機(jī)體氧運輸系統(tǒng)和氧利用系統(tǒng)等多種因素決定[17]，如血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容以及線粒體呼吸鏈各種酶的活性等，敗醬草多糖可能對于上述各項指標(biāo)效果不明顯而影響其耐缺氧效果。

綜上所述，敗醬草多糖可通過提高小鼠的肝糖原儲備與增強(qiáng)糖的有氧代謝而使小鼠游泳時間延長，達(dá)到抗運動疲勞的效果，但對小鼠耐缺氧能力的作用效果不明顯。

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Composition of Polysaccharides from Herba Patriniae and Their Anti-fatigue and Anti-hypoxia Activities

CHI Ai-ping, KANG Chen-zhe, GUO Huan-huan, LI Hong, WANG Yi-min, GUO Fei
(School of Sports, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective: To evaluate the anti-fatigue and anti-hypoxia effects of Herba Patriniae polysaccharide (HPP). Methods: HPP was extracted by using the method of water extraction and subsequent alcohol precipitation, and its main components were determined. A weight loaded swimming model and a hypoxia model in mice were established. Meanwhile, the mice were given different dose of HPP by oral gavage, and their hypoxi a resistance time and swimming time until exhaustion were determined, and then blood lactic acid (BLA) and blood urea nitrogen (BUN) contents, creatine kinase (CK) activity and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen were measured. Results: HPP was a protein-bound polysaccharide composed of D-Man, L-Rha, D-GalUA, D-Glc, D-Gal and L-Ara with a molar ratio of 0.53:0.35:3.18:1:2.72:1.27. HPP could prolong the swimming time until exhaustion of mice and significantly increase the hepatic glycogen level but decrease the levels of BLA and CK. Co nclusion: HPP has an anti-fatigue effect but no antihypoxia effect in mice.

Herba Patriniae polysaccharide; exhaustive exercise; fatigue; hypoxia

G804.7

A

1002-6630（2014）21-0212-04

10.7506/spkx1002-6630-201421041

2014-06-30

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（GK201402046）；陜西師范大學(xué)“211工程”項目（2010-93）

池愛平（1972—），男，副教授，博士，研究方向為運動營養(yǎng)與健康。E-mail：chimu@snnu.edu.cn