郝 瑤，王 陶，李 文,*，李同祥，袁 航

（1.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008；2.中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

富硒獼猴桃果酒酵母的篩選及鑒定

郝 瑤1，王 陶1，李 文1,*，李同祥1，袁 航2

（1.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008；2.中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

通過酵母菌的分離、顯微鏡觀察和WL培養(yǎng)基的篩選，初篩出酵母菌10 株。采用獼猴桃果汁發(fā)酵法、CO2損失質(zhì)量比較法、以及生理生化的鑒定，從中復(fù)篩出一株發(fā)酵能力好、產(chǎn)果香酒香濃郁的菌株Y-41。查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》，初步鑒定該菌株為畢赤酵母屬，再通過分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。對Y-41菌種進(jìn)行了耐受性檢測，結(jié)果表明Y-41對葡萄糖、酒精度、pH值具有較高耐受性，可作為富硒獼猴桃果酒發(fā)酵專用菌種。

富硒獼猴桃；酵母菌；篩選；鑒定

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）被稱為“果中之王”，含有異亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等10多種氨基酸，豐富的鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)，還含有胡蘿卜素、VC及VB等多種維生素，對保持人體健康具有重要的作用[1-2]。獼猴桃具有降血脂[3]、防癌和治癌[4]、抗炎和提高免疫力[5]等作用。獼猴桃果酒中的VC含量特別高，據(jù)檢測每升酒中VC含量為480 mg[6]。

我國獼猴桃野生果實(shí)蘊(yùn)藏量極為豐富，但由于其果實(shí)較小，食用不方便，不耐儲(chǔ)藏，野生獼猴桃資源一直沒有得到很好的開發(fā)利用[7]。硒是人體必需的微量元素，開發(fā)生物源有機(jī)硒食品或食品添加劑是給機(jī)體提供硒源的有效途徑[8-9]。萬源市位于四川東北部，大巴山腹心地帶，是四川省唯一的天然富硒區(qū)，其野生獼猴桃富含硒元素。

釀酒酵母是影響果酒品質(zhì)的重要因素之一，它的選擇會(huì)直接影響果酒的感官和理化品質(zhì)[10-11]。果酒在生產(chǎn)過程中所采用的酵母菌株一般為葡萄酒酵母，然而這種酵母是針對葡萄酒的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)而開發(fā)出來的，具有明顯的針對性，在其他果酒生產(chǎn)中效果并不顯著[12]。目前我國在獼猴桃釀酒研究和釀制過程中，所使用的酵母基本是釀酒活性干酵母或葡萄酒酵母[13-14]。因此，篩選獼猴桃釀酒專用的酵母具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景，獼猴桃釀酒酵母主要通過果實(shí)、自然發(fā)酵液中初步分離篩選，目前已經(jīng)篩選出發(fā)酵性能較好的獼猴桃果酒酵母[15-19]，但尚未見釀造富硒獼猴桃果酒的專用酵母菌株。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可以根據(jù)菌落的特征形態(tài)快速地對發(fā)酵過程中大多數(shù)相關(guān)的酵母進(jìn)行良好的鑒定[20]。因此本實(shí)驗(yàn)擬以四川萬源的野生富硒獼猴桃為研究對象，通過WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基來篩選適合釀造野生富硒獼猴桃果酒所用的酵母菌，并對篩選得到的酵母菌進(jìn)行形態(tài)和生理生化及分子生物學(xué)鑒定，具有一定理論意義和實(shí)際研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

野生富硒獼猴桃，采自四川省萬源市花萼山地區(qū)。

以YPD培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基：酵母浸膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%；WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[20]：酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸鎂0.012 5%、硫酸錳0.000 25%、溴甲酚綠0.002 2%，pH 6.5；保藏培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1.5%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、(NH4)2SO40.1%、瓊脂2%、蒸餾水配制，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸膏、蛋白胨（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；手持糖度計(jì) 上海米青科實(shí)業(yè)有限公司；SWCJ-1F型單人雙面凈化臺(tái) 蘇中凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離

取兩個(gè)成熟的野生富硒獼猴桃，無菌條件下各切取10 g，搗碎，分別放入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩均勻，置于30 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24 h，制成菌懸液。在無菌操作條件下，取原菌懸液100 μL，用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。分別取9 個(gè)梯度的菌懸液100 μL，滴加到Y(jié)PD平板分離培養(yǎng)基上，由低濃度至高濃度涂布均勻。置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落質(zhì)地、菌落顏色及菌落表面特征。

1.3.2 釀酒酵母的初篩

對YPD分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母菌株進(jìn)行初步篩選，挑選無雜菌污染，具有單菌落，表面為球形、突起、光滑、不透明、奶油狀的菌株，在10×40倍顯微鏡鏡檢，觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)特征、繁殖方式等，篩選出以多端出芽繁殖的菌株。

將初篩保藏在斜面培養(yǎng)基上的菌株以劃線分離的方式接種到WL瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行釀酒酵母的篩選，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后觀察形態(tài)，篩選出具有明顯單菌落，顏色為奶油色至綠色，表面為球形突起光滑、不透明、奶油狀的菌株。

1.3.3 釀酒酵母的復(fù)篩

釀酒酵母的一級復(fù)篩：采用杜氏管發(fā)酵法，在同等條件下，將初步篩選的菌種分別接入野生富硒獼猴桃果汁，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，每隔12 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況。初步判斷釀酒酵母的發(fā)酵能力和絮凝能力，進(jìn)一步篩出性狀良好的酵母菌株。

假酵母菌絲的鑒定：為防止假酵母菌絲對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對一級復(fù)篩的菌種進(jìn)行假酵母菌絲的鑒定，將一級復(fù)篩的菌種接種到玉米粉瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察并記錄培養(yǎng)皿中是否有假酵母菌絲的生長。

釀酒酵母的二級復(fù)篩：將經(jīng)過鑒定的一級復(fù)篩菌種所對應(yīng)的斜面菌種接入YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃活化培養(yǎng)24 h，然后取6 mL接入裝有80 mL已滅菌獼猴桃汁的錐形瓶中，稱量各錐形瓶的總質(zhì)量并記錄。將錐形瓶放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)7 d，在無菌條件下釋放瓶內(nèi)的CO2后稱量各錐形瓶的總質(zhì)量，通過CO2損失質(zhì)量法比較各菌株發(fā)酵能力。采用蒸餾法測量各錐形瓶中獼猴桃汁的酒精含量，每株平行3瓶，經(jīng)感官評定酒的風(fēng)味（色澤、香味等）。

1.3.4 菌株的初步鑒定

1.3.4.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

觀察復(fù)篩得到的性狀優(yōu)良菌株的菌落形態(tài)。

1.3.4.2 菌株的生理生化特性鑒定

菌株的生理生化特性鑒定參照文獻(xiàn)[21-22]的方法進(jìn)行。1.3.4.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

提取菌株的基因組DNA[23]，根據(jù)真菌26S rDNA D 1/D 2區(qū)序列保守性設(shè)計(jì)通用引物：前引物5’-C A G A G T T T G AT C C T G G C T-3’，后引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中已有的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行相似性比較分析，分析該菌株的分類地位。

1.3.5 菌株性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 菌株的生長曲線

將菌株接種到滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，觀察60 h菌株的生產(chǎn)情況，前期間隔2 h取樣，后期間隔4、6 h和12 h取樣，用可見分光光度計(jì)在560 nm波長處測其吸光度，重復(fù)5 次，繪制出Y-41菌株生長曲線的變化趨勢。

1.3.5.2 菌株的耐受性實(shí)驗(yàn)[24]

根據(jù)菌株在脅迫梯度液體培養(yǎng)基中的生長情況測定。接種酵母至YPD 液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。調(diào)節(jié)菌液濃度，以接種量為8%分別接種至100 mL酒精（8%、10%、12%、14%、16%）和pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）脅迫梯度液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣1 mL定容到5 mL，測定600 nm波長處吸光度。分別觀察72 h內(nèi)酵母細(xì)胞在相應(yīng)脅迫條件下的生長情況。

1.3.6 分析檢測方法

酵母菌的發(fā)酵能力：CO2損失質(zhì)量法[25]。果汁的糖度用手持糖度計(jì)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

經(jīng)初步分離，共得到10 株符合條件的酵母菌菌株，記為Y-0～Y-9，其形態(tài)特征結(jié)果見表1。

表1 酵母菌分離菌株在YPD培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Table1 Morphological characteristics of isolated yeasts on YPD agar plate

2.2 WL瓊脂培養(yǎng)基初步篩選釀酒酵母

圖1 酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated yeasts on WL agar plate

通過WL瓊脂培養(yǎng)基的初步篩選，共篩選出10 株具有明顯單菌落，菌落顏色為奶油色至綠色，表面為球形突起光滑、不透明、奶油狀的菌株（圖1），對應(yīng)的斜面編號分別為Y-11、Y-13、Y-33、Y-41、Y-52、Y-61、Y-62、Y-71、Y-72、Y-91。

2.3 釀酒酵母的復(fù)篩

2.3.1 釀酒酵母的一級復(fù)篩

將初篩得到的酵母菌菌株分別接入獼猴桃果汁中進(jìn)行一級復(fù)篩，結(jié)果見表2。CO2損失質(zhì)量越高，說明菌株發(fā)酵能力越好。菌株Y-11、Y-13、Y-62、Y-72的起始發(fā)酵力較低，而Y-71、Y-52、Y-41的起始發(fā)酵力顯著高于其他菌株（P＜0.05）；Y-11、Y-13、Y-61、Y-72的總發(fā)酵力較低，Y-91、Y-33、Y-41的總發(fā)酵力較高。一般來講，在一定范圍內(nèi)起始發(fā)酵力和總發(fā)酵力越高，越有利于果酒香氣和風(fēng)味物質(zhì)的形成，所以Y-41、Y-71、Y-33、Y-52、Y-91更有利于提升獼猴桃酒整體品質(zhì)。

表2 不同菌株發(fā)酵時(shí)CO 損失質(zhì)量變化Table2 Changes in CO weight loss during fermentation by yeast isolates

2.3.2 假絲酵母的鑒定

對一級復(fù)篩得到的5 株酵母菌株進(jìn)行假酵母菌絲鑒定，培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)：Y-33、Y-41、Y-91的菌懸液所涂布的培養(yǎng)皿內(nèi)無任何現(xiàn)象，說明沒有假酵母菌絲；Y-52、Y-71的菌懸液所涂布的培養(yǎng)皿內(nèi)則出現(xiàn)假酵母菌絲的生長，在篩選過程中可能因?yàn)榧俳湍妇z的存在導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性，因此Y-52、Y-71兩株菌株不適合用作獼猴桃酒的發(fā)酵。

2.3.3 釀酒酵母的二級復(fù)篩

表3 不同菌株發(fā)酵果酒的各項(xiàng)指標(biāo)Table3 Chemical and sensory indicators of kiwifruit wine fermented by different strains

對剩余的3 株菌株進(jìn)行二級復(fù)篩，結(jié)果見表3。從CO2的總損失質(zhì)量來看，3 株菌株間差距不大，其中Y-41菌株CO2損失質(zhì)量最高。Y-41、Y-33菌株發(fā)酵的果酒，果香酒香濃郁，酒精產(chǎn)率較高，適合做果酒發(fā)酵菌種。

2.4 菌株生理生化鑒定

對3 種菌株進(jìn)行進(jìn)一步生理生化鑒定，選擇最優(yōu)菌株作為發(fā)酵獼猴桃酒的釀酒酵母。由表4可知，碳源中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖均能被菌株Y-33、Y-41、Y-91同化；乳糖、山梨醇、檸檬酸、可溶性淀粉均不能被同化。氮源中硝酸鉀、肌酸和肌酐均不能被3 株菌株同化；硫酸銨不能被菌株Y-33、Y-91同化，但可被菌株Y-41同化利用。菌株Y-41和Y-91在無維生素培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均能生長，Y-33在無維生素培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中不能生長。3 株菌株在37 ℃培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均能生長。尿素酶檢測和重氮基藍(lán)B實(shí)驗(yàn)均為陰性。

表4 酵母菌的生理生化特征Table4 Physiological and biochemical characteristics of different yeast strains

表5 酵母菌在不同糖含量平板培養(yǎng)基中的生長情況Table5 Growth of yeast strains on agar plates with different concentrations of glucose

菌株Y-33、Y-41、Y-91酵母菌耐高糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。3 株菌株在50%、60%、70%的葡萄糖含量下均能生長，在80%的葡萄糖含量下，只有Y-41菌株可以生長，而Y-33、Y-91菌株均不能生長。

根據(jù)以上鑒定結(jié)果，在氮源同化實(shí)驗(yàn)中，Y-41菌株與其他兩株菌株相比，可以同化硫酸銨，對氮源的同化能力相對較強(qiáng)；在酵母菌的耐高糖實(shí)驗(yàn)中，Y-41菌株可以在80%葡萄糖的糖含量中生長，適應(yīng)能力與其他兩株菌株相比較強(qiáng)。結(jié)合酵母菌的二級復(fù)篩結(jié)果，選擇Y-41菌株作為最終發(fā)酵獼猴桃的果酒酵母。根據(jù)酵母菌的特征與鑒定手冊，可以初步判斷Y-41菌株為畢赤酵母屬（Pichia）。

2.5 Y-41菌株的形態(tài)特征

由顯微鏡鏡檢結(jié)果（圖2）可知，Y-41菌株為橢圓形或近圓形，大小為7.9 μm×3.6 μm左右，無性繁殖方式均為多端出芽繁殖。

圖2 顯微細(xì)胞形態(tài)（40×10）Fig.2 Morphology of a single cell observed by microscope (40×10)

2.6 Y-41菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結(jié)果

圖3 Y41菌株26S rDNA D1/D2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of amplified products of 26S rDNA D1/D2 from yeast Y-41

由圖3可知，經(jīng)測序獲得Y-41菌株的26S rDNA 序列，長度為588 bp。將此序列提交到NCBI基因數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明，菌株的序列與Pichia kudriavzevii的26S rDNA序列相似性最高，為100%。應(yīng)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4，進(jìn)化樹表明菌株Y-41與Pichia kudriavzevii（庫德里阿茲威氏畢赤酵母）親緣關(guān)系最近，且在一個(gè)分支中。綜合形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及序列比對結(jié)果，初步鑒定該菌株為Pichia kudriavzevii。

圖4 以菌株的26S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic relationship based on 26S rDNA of Y-41

2.7 Y-41菌株的特性

2.7.1 Y-41菌株的生長曲線

由圖5可知，菌株在培養(yǎng)2 h后菌量以指數(shù)級增加，12 h后菌量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時(shí)間（60 h）內(nèi)酵母菌生長相對較平穩(wěn)。

圖5 Y-41在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.5 Growth curve of Y-41 in YPD medium

圖6 Y-41在不同酒精含量的YPD培養(yǎng)基中的生長情況Fig.6 Growth of Y-41 in YPD medium with different concentrations of alcohol

2.7.2 Y-41菌株對酒精度的耐受性由圖6可知，當(dāng)酒精度≤10%時(shí)，對菌株生長的抑制作用不明顯，當(dāng)酒精度≥12%時(shí)，菌株生長受到嚴(yán)重的抑制，甚至基本不生長。酒精度為8%時(shí)，前12 h酵母菌生長緩慢，12～24 h期間（對數(shù)生長期）生長旺盛；而酒精度為10%時(shí)，前24 h生長緩慢，24～36 h期間生長旺盛，說明在此范圍內(nèi)，酒精度對酵母菌的生長有一定抑制作用。

2.7.3 Y-41菌株對pH值的耐受性

圖7 Y-41在不同pH值的YPD培養(yǎng)基中的生長情況Fig.7 Growth of Y-41 in YPD medium with different pH conditions

由圖7可知，當(dāng)pH≤2.5時(shí)，酵母菌的生長相對于其他pH值的情況下較為緩慢，而當(dāng)pH≥3.0時(shí)，酵母菌的生長曲線近乎吻合。說明酸度對Y-41菌株的生長有一定的影響，隨著酸度的增加，菌體生長變慢，但是整體抑制作用不大。

3 結(jié) 論

通過分離、初篩、復(fù)篩以及生理生化的鑒定，獲得一株適用于富硒獼猴桃果酒發(fā)酵的酵母菌株Y-41。該菌株發(fā)酵能力好、產(chǎn)果香酒香濃郁。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果為：近圓形，多端出芽生殖，菌落突起、表面光滑、邊緣整齊，乳白色，不透明。生理生化特征為：發(fā)酵葡萄糖、蔗糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖、麥芽糖；氮源同化硫酸銨；在無維生素培養(yǎng)基上生長；產(chǎn)類淀粉實(shí)驗(yàn)、尿素酶檢測實(shí)驗(yàn)、重氮基藍(lán)B實(shí)驗(yàn)均為陰性；37 ℃條件下生長；在80%葡萄糖的培養(yǎng)基上生長；根據(jù)以上特征，初步鑒定為畢赤酵母屬（Pichia）。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果：該菌株26S rDNA D1/D2序列長588 bp，將測序得到的序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，與庫中所有酵母菌的同源序列進(jìn)行相似性比較，與畢赤酵母（Pichia）的堿基序列相似度最高，鑒定Y-41菌株為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。對發(fā)酵用菌株Y-41的生長特性及對高酒精度和酸度的耐受性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該菌株耐酸能力較強(qiáng)，耐酒精度為10%。適合進(jìn)行富硒獼猴桃果酒的發(fā)酵。

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Screening and Identification of Yeast for Production of Wine from Selenium-Enriched Kiwifruits

HAO Yao1, WANG Tao1, LI Wen1,*, LI Tong-xiang1, YUAN Hang2
(1. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China; 2. Key Laboratory of Ion Beam Bio-engineering, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China)

Ten yeast isolates were obtained through microscopic observation and screening using WL medium, and one of them was identified by carbon dioxide weight loss comparison as well as physiological and biochemical characterization and named as Y-41. The strain Y-41 was found to have a strong ability to ferment kiwifruit juice into wine with a strong fruity aroma. This strain was preliminarily identified as a member of the genus Pichia according to Yeasts: Characteristics and Identif i cation and further confirmed as Pichia kudriavzevii by molecular biology. Y-41 was highly tolerant to glucose, alcohol and pH, and could be used for wine fermentation from selenium-enriched kiwifruit juice.

selenium-enriched kiwifruit; yeast; screening; identification

Q939.96；TS05

A

1002-6630（2014）21-0175-05

10.7506/spkx1002-6630-201421034

2014-06-30

江蘇省高校青藍(lán)工程項(xiàng)目；江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放課題（SPKF201311）；國家大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目（201311998023）；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（XF13C034）

郝瑤（1992—），女，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：1742706438@qq.com

*通信作者：李文（1982—），女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：wenlisony@126.com