黎 強(qiáng)，盧金清*，郭勝男，蔡君龍，李肖爽

（湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065）

HS-SPME-GC-MS分析不同產(chǎn)地香莢蘭豆揮發(fā)性成分

黎 強(qiáng)，盧金清*，郭勝男，蔡君龍，李肖爽

（湖北中醫(yī)藥大學(xué) 湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065）

目的：分析不同產(chǎn)地香莢蘭豆揮發(fā)性成分的組成。方法：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合惠普-化學(xué)源化學(xué)工作站對不同產(chǎn)地的香莢蘭豆中揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，以峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對含量，并通過主成分分析和聚類分析2 種化學(xué)計(jì)量法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果：初步鑒定出104 種化合物，不同產(chǎn)地香莢蘭豆揮發(fā)性成分有一定差異。結(jié)論：此方法穩(wěn)定可靠，適用于香莢蘭豆揮發(fā)性成分的快速分析，可為香莢蘭豆的質(zhì)量評價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

香莢蘭豆；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃?。痪垲惙治?；主成分分析

香莢蘭豆為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭（Vanilla planifolia Andr.）的成熟果實(shí)，具有息風(fēng)止痙、鎮(zhèn)靜抗驚等功效[1]，其獨(dú)特的香味使其成為高級名酒、香煙、化妝品等的主要配香原料，具有“香料之王”的美譽(yù)[2]。香莢蘭豆浸膏等香莢蘭豆制品廣泛應(yīng)用于飲料、冰琪淋、糖果、巧克力、培烤食品以及酒類和香煙中[3]。其主產(chǎn)于馬達(dá)加斯加、科摩羅、塔希提、墨西哥、印度尼西亞、留旺尼、烏干達(dá)、塞舌爾、毛里求斯等島嶼國或地區(qū)，全世界每年生產(chǎn)干燥完畢的香莢蘭豆莢約2 000～2 400 t[4]。中國海南地區(qū)[5]、中國福建地區(qū)[6]也都有種植。目前，國內(nèi)外對香莢蘭豆香味成分研究已較為深入，郭彧等[1]研究發(fā)現(xiàn)香莢蘭豆原料中含有醛類、酚類、醇類、酸類、酯類、酮類等物質(zhì)，其中最為主要的揮發(fā)性物質(zhì)為香蘭素和愈創(chuàng)木酚。任洪濤等[7]采用同時(shí)蒸餾萃取方法收集了香莢蘭豆中的揮發(fā)性成分，對所得的揮發(fā)性成分的二氯甲烷濃縮液用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行分析，結(jié)果共鑒定出49 種化合物，其中含量較高的有2,3,5,6-四甲基苯酚（9.25%）、香蘭素（8.09%）、愈創(chuàng)木酚（7.93%）。陸舍銘等[8]用同時(shí)蒸餾萃取和固相微萃取作為2 種前處理方法并結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行分析，結(jié)果得出2 種前處理方式中揮發(fā)性成分含量最高的均為香蘭素。但對不同產(chǎn)地香莢蘭豆的研究卻鮮見報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro extraction，HS-SPME）與GC-MS聯(lián)用技術(shù)對中國海南、科摩羅、馬達(dá)加斯加、中國福建、印度尼西亞5 個(gè)產(chǎn)地共15 個(gè)批次香莢蘭豆中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒別，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立快速分析香莢蘭豆揮發(fā)性成分的方法，并為香莢蘭豆的品質(zhì)客觀評價(jià)指標(biāo)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國海南產(chǎn)香莢蘭豆（樣品編號為1、2、3）；科摩羅產(chǎn)香莢蘭豆（樣品編號為4、5、6）；馬達(dá)加斯加產(chǎn)香莢蘭豆（樣品編號為7、8、9）；中國福建產(chǎn)香莢蘭豆（樣品編號為10、11、12）；印度尼西亞產(chǎn)香莢蘭豆（樣品編號為13、14、15），由武漢黃鶴樓香精香料有限公司提供，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭的成熟果實(shí)。

1.2 儀器與設(shè)備

6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；NIST系列標(biāo)準(zhǔn)譜庫、65 μm PDMS/DVB萃取頭、手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器裝置、15 mL樣品瓶 美國Supelco公司；ALC-210.2電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件

前期對藥材取樣量、平衡溫度、萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、萃取頭種類等因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明香莢蘭豆中香蘭素等主要風(fēng)味物質(zhì)在110 ℃條件下的相對含量最高，由此確定固相微萃取的最佳條件：即取香莢蘭豆2 g，剪碎，置于15 mL配有聚四氟乙烯膠墊的頂空瓶中，用帶有65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器插入瓶內(nèi)，110 ℃平衡15 min，推出萃取頭頂空萃取15 min，取出，立即插入色譜儀進(jìn)樣口（溫度250 ℃），解吸3 min。

1.3.2 GC-MS的分析

1.3.2.1 GC條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為35 ℃，以6 ℃/min升至132 ℃，保留1 min，再以15 ℃/min升至147 ℃，再以10 ℃/min升至160 ℃，最后以15 ℃/min升至190 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣。

1.3.2.2 MS條件

離子源：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；倍增管電壓1.2 kV；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用主成分分析和系統(tǒng)聚類分析2 種數(shù)據(jù)分析方法對各樣品的HS-SPME-GC-MS所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理及用面積歸一化法從各總離子流圖（圖1）中計(jì)算各組分相對含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng)NIST譜庫檢索，確定各個(gè)組分，初步鑒定了104 種化合物，分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的香莢蘭豆揮發(fā)性成分種類和相對含量有一定量的差異，但均含有香蘭素、愈創(chuàng)木酚、丁香酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、草蒿腦等18 種主要成分。香蘭素（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛），又名香草醛、香草素、香蘭醛或香茅醛，是香子蘭豆莢中的一種主要成分，通常作為香料、天然藥物和醫(yī)藥中間體[9]，近年來研究又表明香蘭素具有抗菌性能[10-11]，并且已有研究發(fā)現(xiàn)以香蘭素為原料合成香豆酮和香蘭素衍生物新型席夫堿具有更強(qiáng)的抑菌效果[12-14]，除了作為增香劑外，香蘭素常作為含有多不飽和組分食品的抗氧化劑[15]。愈創(chuàng)木酚可以用來合成香蘭素，其生產(chǎn)量占整個(gè)香蘭素生產(chǎn)量的70%以上[16]，愈創(chuàng)木酚是一種重要的酚類香料[17]。丁香酚本身就是一種重要的風(fēng)味代謝物，是形成香蘭素的前體物質(zhì)[18]，還具有抗病毒、清除氧自由基功效[19]。4-甲基愈創(chuàng)木酚也是最重要的風(fēng)味物質(zhì)[20]。在得到的104 種揮發(fā)性成分中，15 個(gè)批次的香莢蘭豆含有的共有化合物有18 種，分別為香蘭素、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、丁香酚、草蒿腦、α-蒎烯、糠醛、正辛醇、1-石竹烯、1-辛烯-3-醇、α-反式佛手柑油烯、肉桂酸甲酯、1-金剛烷醇、2-正丁基呋喃、對苯二甲醚、14-甲基十六烷酸甲酯、環(huán)十二酮、縮氨基硫脲、2,3,4-三甲基正己烷。以18 個(gè)共有峰的峰面積作為變量，得到15×18的數(shù)據(jù)矩陣，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

圖1 馬達(dá)加斯加香莢蘭豆總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Madagascar vanilla bean

2.1 主成分分析

將二維數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入到SPSS 19.0軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為89.151%，第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為10.607%，前2 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為99.758%。一般來說，提取主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到80%～85%，可據(jù)此決定需要提取多少個(gè)主成分[21]。從圖2可知，印度尼西亞、科摩羅、馬達(dá)加斯加3 個(gè)產(chǎn)地的樣品在分布上相對集中，而中國海南、中國福建2 個(gè)產(chǎn)地的樣品在分布上相對集中，不同產(chǎn)地的樣品在分布上則有明顯差異。結(jié)果表明，采用主成分分析法能夠反映出不同產(chǎn)地香莢蘭豆成分差異，可以有效地

區(qū)分中國海南、科摩羅、馬達(dá)加斯加、中國福建、印度尼西亞的香莢蘭豆。

表1 15 個(gè)批次香莢蘭豆揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 Volatile components of 15 batches of vanilla bean

續(xù)表1

圖2 15 批香莢蘭豆樣品的主成分分析得分圖Fig.2 Principal component analysis of 15 batches of vanilla bean

2.2 系統(tǒng)聚類分析

利用SPSS 19.0軟件，采用Ward’s聚類法，以Euclidean距離為測度、峰面積百分率為基準(zhǔn)，對15 個(gè)批次5 個(gè)產(chǎn)地的香莢蘭豆進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖3所示，樣本層次聚類分析聚成4 類，樣品1、2、3聚為一類，樣品4、5、6聚為一類，7、8、9聚為一類，樣品10、11、12聚為一類，13、14、15聚為一類。圖3直觀地顯示了整個(gè)聚類過程，縮小了憑借主觀判斷造成的誤差。聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的香莢蘭豆具有明顯的內(nèi)在差異，同一產(chǎn)地的香莢蘭豆在化學(xué)成分上具有相似性。

圖3 15 批次香莢蘭豆樣品的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of 15 batches of vanilla bean

3 討 論

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對中國海南、科摩羅、馬達(dá)加斯加、中國福建、印度尼西亞5 個(gè)產(chǎn)地的香莢蘭豆進(jìn)行分析，該方法前處理簡單，無需采用有機(jī)試劑，樣品用量少，快速準(zhǔn)確。共鑒定出了104 種化合物，18 種為共有成分，其中相對含量最高的為香蘭素，5 個(gè)產(chǎn)地香蘭素的平均含量分別為30.97%、48.14%、51.83%、23.73%、42.09%，馬達(dá)加斯加產(chǎn)香莢蘭豆中香蘭素的含量明顯高于印度尼西亞、中國海南、中國福建3 個(gè)產(chǎn)地，略高于科摩羅，可能是由于香莢蘭豆的種植土壤、氣候等生境條件不同，使植物次生代謝過程存在差異。

采用主成分分析法和聚類分析法2 種化學(xué)模式識(shí)別方法對HS-SPME-GC-MS分析所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，該方法不僅可以綜合地反映相同產(chǎn)地香莢蘭豆間的相似關(guān)系，而且可以全面地反映不同產(chǎn)地藥材間的差異，使分析結(jié)果更為直觀、客觀。

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Analysis of Volatile Components of Vanilla Beans from Different Habitats by HS-SPME-GC-MS

Objective: To analyze the volatile components of vanilla beans from different habitats. Methods: The contents of volatile components from vanilla beans were determined by peak area normalization method. The separated volatile components were identified by GC-MS. Results: Totally 104 volatile components were identified preliminarily. There were differences in volatile components of vanilla beans from different habitats. Conclusion: The analytical method presented in this study is reliable and stable and can be applied for the analysis of volatile components of vanilla beans.

vanilla bean; volatile components; headspace solid phase micro extraction; cluster analysis; principal component analysis

R284.1

A

1002-6630（2014）22-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201422048

2014-03-07

黎強(qiáng)（1990—），男，碩士研究生，主要從事中藥及其天然產(chǎn)物活性成分研究。E-mail：18986157273@163.com

*通信作者：盧金清（1955—），男，教授，學(xué)士，主要從事中藥及其天然產(chǎn)物活性成分研究。E-mail：ljq59169@sohu.com

LI Qiang, LU Jin-qing*, GUO Sheng-nan, CAI Jun-long, LI Xiao-shuang

(Hubei Medicinal Plants Co-Laboratory of Universities and Enterprises, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)