楊 潔，王 智，張輝珍*，翟士星，于 宙，張鳳艷，殷冀煜，王曉斌

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東 青島 266061）

液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定火鍋湯料中的罌粟堿

楊 潔，王 智，張輝珍*，翟士星，于 宙，張鳳艷，殷冀煜，王曉斌

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東 青島 266061）

采用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，多反應(yīng)檢測(cè)模式定量，建立火鍋湯料中5 種罌粟堿殘留的分析方法，優(yōu)化了樣品的前處理過(guò)程、色譜條件、質(zhì)譜參數(shù)等條件。嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的檢出限分別為2.4、2.4、1.2、0.048、0.024 ng/mL，定量限分別為8.0、8.0、4.0、0.16、0.08 ng/mL，加標(biāo)回收率介于81.3%～103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于3.02%～4.55%。本方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)火鍋湯料中是否添加了罌粟殼進(jìn)行快速檢測(cè)分析。

罌粟堿；高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)

罌粟殼含有20多種生物堿，其中主要成分為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁[1]。罌粟殼中的生物堿能引起某種程度的愜意和欣快感，可造成人注意力、思維和記憶功能的衰退，長(zhǎng)期使用會(huì)引起精神失常，出現(xiàn)幻覺(jué)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致呼吸停止而死亡。添加了罌粟殼的食物口感獨(dú)特，有些不法商販在火鍋湯料中添加罌粟殼，長(zhǎng)期食用無(wú)論從身體上還是心理上都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生嚴(yán)重的依賴性，造成嚴(yán)重的毒物癖[2]。由于罌粟殼對(duì)人體的危害逐漸被人所認(rèn)識(shí)，食品中違法添加罌粟殼及其提取物也逐漸引起人們的關(guān)注，為了維護(hù)廣大人民的身體健康，嚴(yán)厲打擊非法添加現(xiàn)象，建立快速、準(zhǔn)確的食品中生物堿的測(cè)定方法具有重要意義。

目前測(cè)定罌粟堿的方法主要有分光光度法[3]、薄層色譜法[4-5]、示波極譜法[6-7]、氣相色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有較高的檢測(cè)靈敏度，適用于食品中生物堿殘留的測(cè)定，但目前的檢測(cè)方法前處理相對(duì)較為繁瑣，不適合大批樣品的快速檢測(cè)分析。為此，本實(shí)驗(yàn)選用嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁5 種生物堿作為火鍋湯料中添加罌粟殼的標(biāo)示成分，建立了簡(jiǎn)便快速的前處理分析方法，并用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性定量測(cè)定，具有準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿，那可丁5 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 青島市公安局；甲醇（色譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水、乙酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）填料：粒度40～70 μm；C18填料：40～50 μm；超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Quattro Premier XE液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；超聲波清洗器、旋渦混合器。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為10 mmol/L的乙酸銨溶液；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫：0～1 min，保持A、B的比例為60∶40；1～6 min，A∶B的比例從60∶40逐漸增加到100：0；6～7 min，A∶B的比例降至60∶40，保持4 min。1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)控掃描模式。毛細(xì)管電壓3.2 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度120 ℃；RF透鏡1.2∶1；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；碰撞室氬氣壓力0.3 Pa。各化合物質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5 種生物堿質(zhì)譜參數(shù)Table1 Mass spectral parameters for five alkaloids

1.3.3 樣品預(yù)處理

稱取5 g樣品于25 mL比色管中，加0.625 mL氨水，加入15 mL甲醇，將比色管放入超聲波中超聲20 min，取出，冷卻至室溫，加水定容至刻度，搖勻，8 000 r/min離心5 min，取出待凈化。稱取60 mg PSA，60 mg C18于10 mL聚四氟乙烯離心塑料管中，移取2 mL上清液于此離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

稱取5 g空白試樣于25 mL比色管中，添加一定濃度的該5 種生物堿，加入0.625 mL氨水，以保持溶液為堿性，加入甲醇0、0.5、1、2.5、5、10、15、20 mL，再向前7 個(gè)試樣中加入適量水（總試液體積為20 mL左右），超聲20 min，取出，冷卻至室溫，用水定容至刻度，第8個(gè)試樣用甲醇定容至刻度，搖勻，8000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.5 樣品中罌粟堿含量計(jì)算

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得的生物堿質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為提取液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁均易溶于甲醇，因此選用甲醇作為流動(dòng)相A，用100%的甲醇作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)這5 種生物堿無(wú)法得到有效分離。結(jié)合資料[16]選擇10 mmol/L的乙酸銨溶液作為流動(dòng)相B，選用初始流動(dòng)相甲醇與乙酸銨的比例分別為55∶45、60∶40、65∶35，發(fā)現(xiàn)在55∶45時(shí)峰形較寬，在60∶40和65∶35時(shí)均得到較好的峰形，但在65∶35時(shí)嗎啡與可待因之間分離不好。因此選用初始甲醇（A）和乙酸銨（B）的比例為60∶40，在優(yōu)化條件下發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的變化梯度為0～1 min，保持V（A）∶V（B）=60∶40；1～6 min，V（A）∶V（B）= 60∶40逐漸增加為V（A）∶V（B）=100∶0；6～7 min間，A與B的比例降至60∶40，保持4 min。在該條件下5 種化合物得到有效分離，并且縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率，為大批樣品的快速分析提供參考。

2.2 樣品提取試劑的選擇

首先配制3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液1，嗎啡、可待因和蒂巴因質(zhì)量濃度均為2 μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)溶液2，罌粟堿質(zhì)量濃度200 ng/mL；標(biāo)準(zhǔn)溶液3，那可丁質(zhì)量濃度為100 ng/mL。移取50 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液1、20 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液2和20 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液3，配制成混合溶液4、混合溶液5和混合溶液6各1 mL?；旌先芤?、5、6中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁的質(zhì)量濃度都分別為100、100、100、4 ng/mL和2 ng/mL?；旌先芤?、5和6采用的稀釋劑分別為：50%甲醇（含2.5%乙酸）、50%甲醇和50%甲醇（含2.5%氨水）。將這3 種混合溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖1所示。由于罌粟殼中的生物堿在酸性（圖1a）和中性（圖1b）條件下水溶性增加，導(dǎo)致嗎啡、可待因、蒂巴因在柱中無(wú)保留，造成峰形差，峰高低。堿性條件下（圖1c），在柱中保留時(shí)間延長(zhǎng)，明顯改善其色譜行為，化合物的流出順序?yàn)閱岱龋?.37 min）、可待因（1.88 min）、蒂巴因（2.55 min）、罌粟堿（3.86 min）和那可丁（4.74 min）。

由于該5 種生物堿在酸性條件下形成鹽類易溶于水，因此以往的分析前處理方法中均采用酸性溶液提取食品中的罌粟殼殘留物，再經(jīng)過(guò)MCX柱固相萃取，用堿性甲醇洗脫，濃縮后再進(jìn)行進(jìn)樣分析，此方法操作過(guò)程相對(duì)較為繁瑣，為了簡(jiǎn)化操作流程，利用該5 種生物堿在堿性條件下易溶于有機(jī)溶劑的特性，選擇有機(jī)溶劑在堿性條件下提取試樣中罌粟殼殘留成分，并考察不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的提取效率，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從0～100%，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，5 種生物堿均能獲得較高的峰面積。因此測(cè)定火鍋湯料樣品時(shí)，稱量樣品5 g于25 mL比色管中，堿性條件下（加入0.625 mL氨水）加入純甲醇15 mL，按上述步驟超聲提取，定容，搖勻即可。

圖1 不同稀釋溶劑稀釋的生物堿的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of alkaloids in different diluents

圖2 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)提取試劑對(duì)5 種生物堿提取效率的影響Fig.2 Extraction efficiency of five alkaloids with different concentrations of methanol

2.3 凈化方法的選擇

火鍋湯料中含有大量的蛋白質(zhì)和油脂，并且含有成分復(fù)雜的調(diào)味料，這些組分的存在都會(huì)干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定，因此對(duì)提取液進(jìn)行凈化已成為準(zhǔn)確測(cè)定的關(guān)鍵步驟之一。研究[17]表明提取液經(jīng)過(guò)MCX柱吸附、洗脫后取得較好的凈化效果[17]。但是由于火鍋湯料中組成成分相對(duì)復(fù)雜，通過(guò)固相小柱時(shí)可造成流速較慢，洗脫困難，并且操作步驟也相對(duì)繁瑣。為了解決以上問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取法來(lái)對(duì)提取液進(jìn)行凈化，直接將固相吸附劑加入提取液中，該操作簡(jiǎn)便快捷。結(jié)合資料[18]，PSA是極性吸附劑，同時(shí)含有伯胺和仲胺基團(tuán)，具有弱的陰離子交換能力，有利于去除油脂和糖，C18有利于去除湯料中的色素，因此選用PSA和C18作為凈化劑，去除雜質(zhì)干擾。稱取60 mg PSA、60 mg C18于10 mL聚四氟乙烯離心塑料管中，移取2 mL待凈化上清液于此離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過(guò)濾，分析結(jié)果表明雜質(zhì)峰明顯減少，并能獲得較高的回收率。

2.4 方法的線性實(shí)驗(yàn)

將5 種生物堿配制成嗎啡、可待因、蒂巴因均為100 ng/mL，罌粟堿4 ng/mL，那可丁2 ng/mL的混合溶液，再取這5 種生物堿的混合溶液100、200、300、400、500 μL于瓶中，定容至1 mL，進(jìn)樣分析，以組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

表2 5 種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線Table 2 Standard regression curves for five alkaloids

2.5 方法的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

圖3 空白基質(zhì)（a）和加標(biāo)基質(zhì)（b）總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of blank and spiked matrix-matched samples

取空白試樣12 份，分為兩組，每組6 份進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。第1組加入低質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使配制后試液中的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁質(zhì)量濃度分別為10、10、10、0.4 ng/mL和0.2 ng/mL。第2組加入高質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使配制后試液中的上述5 種化合物質(zhì)量濃度分別為30、30、30、1.2 ng/mL和0.6 ng/mL。按1.3.3節(jié)的前處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，空白基質(zhì)及加標(biāo)樣品的總離子流圖如圖3所示。該5 種化合物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3?；厥章试?1.3%～103.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于3.02%～4.55%之間。

表3 5 種生物堿回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Precision (RSD) and recoveries of five alkaloids

2.6 方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)

將嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁配制成10、10、10、0.4、0.2 ng/mL后進(jìn)樣，3倍信噪比條件下溶液質(zhì)量濃度為檢出限，可推算出這5 種生物堿的絕對(duì)檢出限分別為2.4、2.4、1.2、0.048、0.024 ng/mL，10倍信噪比條件下溶液質(zhì)量濃度為最低定量限，得出這5 種生物堿的最低定量限分別為8.0、8.0、4.0、0.16、0.08 ng/mL。

3 結(jié) 論

采用三重四極桿的電噴霧離子源，使用多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，能對(duì)嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁進(jìn)行準(zhǔn)確分析，方法檢出限分別為2.4、2.4、1.2、0.048、0.024 ng/mL，可獲得較低的檢出限，能滿足火鍋湯料中罌粟殼殘留的分析測(cè)定。選用大于60%的甲醇溶液在堿性條件下能充分提取樣品中罌粟殼殘留物，回收率在81.3%～103.5%之間，使用該前處理方法，進(jìn)樣分析，所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于3.02%～4.55%之間，該方法適用于大批食品中罌粟殼殘留的準(zhǔn)確、快速測(cè)定。

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Determination of Papaverine and Other Alkaloids in Hot Pot Soup Seasoning by HPLC-MS-MS

YANG Jie, WANG Zhi, ZHANG Hui-zhen*, ZHAI Shi-xing, YU Zhou, ZHANG Feng-yan, YIN Ji-yu, WANG Xiao-bin
(Qingdao Supervision and Testing Center of Product Quality, Qingdao 266061, China)

A method for the determination of five alkaloid residues in hot pot soup seasoning using a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS) was described. The pretreatment procedure, chromatographic conditions and mass spectrometric conditions were optimized. The detection limits for morphine, codeine, thebaine, narcotine and papaverine were 2.4, 2.4, 1.2, 0.048 and 0.024 ng/mL and the quantitative determination limits were 8.0, 8.0, 4.0, 0.16 and 0.08 ng/mL, respectively. The spiked recoveries were between 81.3% and 103.5%, and the relative standard deviations ranged from 3.02% to 4.55%. This method has the advantages of easy operation, high sensitivity and accuracy.

papaveirne; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; multi-reaction monitoring (MRM)

TS207.3

A

1002-6630（2014）22-0243-04

10.7506/spkx1002-6630-201422047

2013-12-19

楊潔（1982—），女，工程師，博士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。E-mail：mxvv@sina.com

*通信作者：張輝珍（1966—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。E-mail：zhanghuizhen1966@sina.com