劉國艷，張?zhí)锾?，王金星，孫貝貝，邊 昊，徐 鑫*

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

酶法富集小黃魚內臟魚油中EPA和DHA甘油酯

劉國艷，張?zhí)锾?，王金星，孫貝貝，邊 昊，徐 鑫*

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

目的：以小黃魚內臟精煉魚油為原料，通過脂肪酶選擇性水解法富集二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）甘油酯和二十二 碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA） 甘油酯。方法：采用氣相色 譜峰面積外標法定量測定EPA和DHA甘油酯總含量。通過單因素 和響應面試驗，考察反應時間、pH值、反應溫度、加酶量等因素對富集效果的 影響。結果：確定最佳工藝條件為反應時間4 h、pH 8.0、反應溫度30 ℃、加酶量1.0 %，在 此條件下，EPA和DHA甘油酯總含量為21.65%，且4 個因素對EPA和DHA甘油酯富集的影響依次增強。結論：富集后魚油理化指標和感官評價均優(yōu)于精煉魚油，EPA和DHA甘油酯總含量是富集前的1.74 倍，獲得了天然的EPA和DHA甘油酯。

脂肪酶；小黃魚內臟；精煉魚油；EPA甘油酯；DHA甘油酯

小黃魚作為我國四大海洋經(jīng)濟魚類之一，目前其加工下腳料主要用于飼料[1]（魚粉、液體魚蛋白飼料、寵物食品）、調味品[2]（魚露、海鮮調味料）等方面，而對下腳料的深加工，如提取魚油、制備多糖和多肽等方面研究報道較少[3]。多不飽和脂肪酸對人體正常的生長和營養(yǎng)是必需的，而某些飽和脂肪酸及其他雜質在體內長期積累是有害的[4]，小黃魚內臟中富含多不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）甘油酯和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）甘油酯在人體中具有重要的生物學意義，如抑制腫瘤生長、預防心血管疾病、促進智力發(fā)育[5-7]等，且對細胞代謝、信號傳導和基因表達調控起著重要作用[8]。然而，從天然海產(chǎn)魚制得的多不飽和脂肪酸中，EPA和DHA的含量因魚的種類而不同，通常在5%～15%[9]?，F(xiàn)有報道中，提高魚油中EPA和DHA甘油酯含量的方法主要有：低溫結晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、超臨界CO2萃取法、色譜法、脂肪酶法等[10]，其中低溫結晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、超臨界CO2萃取法及色譜法，主要是針對EPA和DHA乙酯型魚油進行富集，但EPA和DHA乙酯型魚油不易于被人體消化吸收，而且可能存在安全隱患；脂肪酶法主要是針對EPA和DHA甘油酯型進行富集，EPA和DHA甘油酯型即為魚油中天然存在形式，其性質穩(wěn)定，不易氧化，口感好，易被人體消化吸收。研究[11]表明脂肪酶具有對甘油酯中不同脂肪酸的專一性，通常認為魚油三甘酯中2-位上連接著EPA、DHA等高度不飽和脂肪酸。脂肪酶選擇性水解法是利用某些脂肪酶相對特異性地水解甘油與飽和脂肪酸聯(lián)接的酯鍵，而對不飽和脂肪酸幾乎無作用的原理，去除游離的飽和脂肪酸，提高魚油中多不飽和脂肪酸的含量。小黃魚內臟下腳料是一種廢棄資源，其中含有豐富的多不飽和脂肪酸，直接排放會造成環(huán)境污染和資源浪費。我國海洋資源豐富，但EPA和DHA富集分離技術比日本和西方發(fā)達國家相比還相差甚遠[12]。本研究采用脂肪酶Lipozyme TL 100 L水解小黃魚內臟精煉魚油，富集EPA和DHA甘油酯，通過單因素和響應面試驗確定最佳酶解條件，提高EPA和DHA甘油酯含量，為加工魚油提供一種新的原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚內臟精練魚油 實驗室自制（EPA和DHA甘油酯總含量以EPA和DHA總含量計，為12.35%）；Lipozyme TL 100L脂肪酶 丹麥諾維信公司；37種脂肪酸甲酯標準品 美國Sigma公司；三氟化硼（色譜純） 阿拉丁試劑公司；正己烷、甲醇（均為色譜純）江蘇漢邦科技有限公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；XW-80A漩渦混合儀 上海青浦滬西儀器廠；L-550臺式低速大容量離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；GC-2014氣相色譜儀（氫火焰離子化檢測器）日本島津公司；Optima 7300DV電感耦合等離子體光譜儀（配有氫化物發(fā)生系統(tǒng)） 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶對EPA和DHA甘油酯的富集

[13]方法略作修改。稱取10 g精煉魚油置于150 mL錐形瓶中，加入4 mL磷酸鹽緩沖溶液，混勻后加入一定量的脂肪酶（以魚油質量計），充氮密封，置于電熱恒溫水浴鍋中反應一段時間。反應結束后，將反應體系溶液轉移到分液漏斗中，加入適量正己烷振蕩，待靜置分層后，收集上層溶液；然后用去離子水反復洗滌上層溶液至中性，收集上層正己烷萃取液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)除去溶劑，即得EPA和DHA甘油酯。

1.3.2 酶解工藝條件的單因素試驗設計

以EPA和DHA甘油酯含量為考察指標，分別設計緩沖液pH 4.0、5.5、7.0、8.5、10.0，反應溫度20、30、40、50、60℃，反應時間2、4、6、8、10 h，脂肪酶用量（質量分數(shù)）0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%，探究其對魚油EPA和DHA甘油酯富集效果的影響。固定pH 7.0、反應溫度40 ℃、反應時間4 h、加酶量1.0%，每次改變其中一個因素，分析各因素對魚油中EPA和DHA甘油酯富集效果的影響。

1.3.3 酶解工藝條件的響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇影響較大的3個因素利用Design-Expert 8.0軟件進行響應面優(yōu)化設計。設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，因素水平和編碼見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in RSM design

1.3.4 EPA和DHA含量的測定

1.3.4.1 EPA和DHA標準溶液的配制

取脂肪酸標準品（EPA和DHA含量分別為2%）100 mg，用正己烷溶解定容至10 mL，配制成質量濃度均為0.2 mg/mL的EPA和DHA標準母液。將母液分別稀釋成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的標準品溶液，備用。1.3.4.2 魚油甲酯化

稱取50 mg魚油樣品加入1.5 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，充入氮氣，密封，混勻，65 ℃水浴20 min，冷卻至室溫；加入2 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，充入氮氣、密封、混勻，65 ℃水浴5 min，冷卻至室溫；加入1 mL正己烷，充入氮氣，密封，混勻30 s；加入5 mL飽和氯化鈉溶液，充入氮氣，密封，混勻1 min。靜置分層后，吸取上層正己烷溶液過0.22 μm濾膜，上機待測。

1.3.4.3 氣相色譜條件

色譜柱：FFAP石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；氫火焰離子化檢測器；進樣口溫度：250℃，檢測器溫度：250℃；流速：1.0 mL/min，載氣：氮氣，壓力：500 kPa，氫氣壓力：50 kPa，尾吹氣壓力：200 kPa，空氣壓力：50 kPa；程序升溫：50 ℃保留4 min，4 ℃/min升溫至140 ℃，5 ℃/min升溫至220 ℃，保持40 min；進樣量1 μL。

1.3.4.4 定量分析

采用外標 法，建立標準曲線，峰面積定量計算結果。

1.3.5 富集魚油理化指標測定

酸值：GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》[14]；碘值：GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》[15]；過氧化值：GB/T 5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》[16]；重金屬離子Hg、As、Pb含量：采用電感耦合等離子體質譜法[17]；感官評價：SC/T 3502—2000《水產(chǎn)行業(yè)標準魚油》[18]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

37 種脂肪酸甲酯標準品和樣品氣相色譜圖如圖1所示。采用峰面積外標法對EPA和DHA含量進行定量。

圖1 脂肪酸甲酯標準品（a）和樣品（b）氣相色譜圖Fig.1 GC patterns of fatty acid methyl ester standard (a) and sample (b)

分別以EPA、DHA質量濃度（mg/mL）為橫坐標X，目標峰的峰面積為縱坐標Y，以X對Y進行線性回歸，得回歸方程：YEPA=53 611.75XEPA+1 494.40，R2=0.990 3；YDHA=16 887.50XDHA+897.54，R2=0.991 3。

2.2 酶解工藝對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響

2.2.1 pH值對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響

圖2 pH值對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響Fig.2 Effect of pH on the enrichment of EPA and DHA glycerides

由圖2可見，溶液從酸性到弱堿性，EPA和DHA甘油酯總含量不斷增大，在強堿性時開始降低。結合所用脂肪酶的自身最適pH值范圍，選取緩沖液pH 7.0～9.0作為酶解反應的pH值范圍。

2.2.2 反應溫度對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響

圖3 反應溫度對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the enrichment of EPA and DHA glycerides

由圖3可見，反應溫度從20 ℃升至30 ℃時，EPA和DHA甘油酯總含量略有增加；30～40 ℃范圍內，含量略有降低；溫度超過40 ℃后，含量下降較快，這與本實驗選用的脂肪酶在中低溫條件下活力較高相符合。綜合考慮，選取反應溫度的最佳范圍為20～40 ℃。

2.2.3 反應時間對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響

圖4 反應時間對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響Fig.4 Effect of reaction time on the enrichment of EPA and DHA glycerides

如圖4所示，反應4 h時，EPA和DHA甘油酯總含量達到最大值，隨著反應時間延長，EPA和DHA甘油酯總含量呈下降趨勢。這可能是因為水中殘存的部分氧與多不飽和脂肪酸在高溫下長期接觸，使得EPA和DHA甘油酯發(fā)生自動氧化或光敏氧化而損失。為此，選取4 h作為最佳反應時間。

2.2.4 加酶量對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響

圖5 加酶量對EPA和DHA甘油酯富集效果的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on the enrichment of EPA and DHA glycerides

從圖5可以看出，EPA和DHA甘油酯總含量隨著脂肪酶添加量的增加而增加。加酶量在0.6%～1.4%的范圍內EPA和DHA甘油酯總含量上升趨勢漸緩，故選取加酶量最佳范圍為0.6%～1.4%。

2.3 響應面優(yōu)化EPA和DHA甘油酯富集工藝

2.3.1 響應面試驗

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

單因素試驗中反應溫度、加酶量、pH值、反應時間的極差分別為4.960、3.605、3.395、3.035，故選取pH值、反應溫度、加酶量作為響應面試驗設計的三因素。響應面試驗設計及結果見表2。對表2數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表3，模型的F值為3.71，P值小于0.05，表明模型顯著；失擬項值也都大于0.05，表明該模型失擬不顯著，具有較好的擬合度。

根據(jù)回歸系數(shù)可得二次多項回歸模型方程：

Y=19.35+0.42A－0.91B－0.42C+1.52AB－0.19AC－1.49BC－2.33A2－2.44B2－2.74C2，其中R2=0.826 7，回歸系數(shù)顯著性結果表明A2、B2項和C2項P＜0.05，均為顯著項。

2.3.2 響應面分析

圖6 緩沖液pHH值（A）、反應溫度（B）和加酶量（C）對魚油EPA和DHA甘油酯富集效果的響應面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of pH (A) and reaction temperature (B) and enzyme amount (C) on the enrichment of EPA and DHA glycerides

利用Design-Expert 8.0軟件繪制出該模型的三維響應面圖，如圖6所示。pH值（A）、反應溫度（B）和加酶量（C）對EPA和DHA甘油酯總含量的影響呈拋物線狀，即在一定范圍內，隨著因素水平的增大，各指標響應值先增大后減小，通過試驗求出這3 個因素的最適參數(shù)，從而確定影響魚油EPA和DHA甘油酯富集能力的因素從大到小依次pH值、反應溫度、加酶量。以EPA和DHA甘油酯總含量為最終評價指標，最優(yōu)條件范圍：pH 7.5～8.7、反應溫度22～34℃、加酶量0.75%～1.15%。軟件預測Y為19.44%，此時最優(yōu)條件為pH 8.0、反應溫度28.37 ℃（實際操作中不易實現(xiàn)，故選取30℃）、加酶量1.0%、反應時間4 h。為了驗證該模型的可靠性，以最佳實驗條件進行了3次平行實驗，EPA和DHA甘油酯總含量平均值為21.65%，模型預測值與理論值相對偏差為10.21%。

鄭毅等[19]采用固定化米曲霉脂肪酶選擇性富集魚油ω-3多不飽和脂肪酸甘油酯，得到EPA和DHA總含量由7.3%提高到21.5%，本實驗所用脂肪酶Lipozyme TL 100 L同樣是米曲霉脂肪酶，得到的提取率比其高0.15%；劉書成等[13]研究蛇鯔精煉魚油經(jīng)脂肪酶OF選擇性水解后，EPA和DHA總含量由14.38%提高到34.1%，其原料精煉魚油中EPA和DHA的初始含量比本實驗原料中EPA和DHA高，并且蛇鯔為熱帶和亞熱帶海區(qū)中下層魚類，本實驗所用小黃魚為近海低值魚類，所含的EPA和DHA的含量比其低。

2.4 富集魚油理化指標測定

表4 富集魚油理化指標和感官指標Table 4 Physicochemical and sensory properties of enriched fish oil

由表4可知，富集后的魚油過氧化值和酸值分別減少了0.13 mmol/kg、0.37 mg/g，碘值增加了20.33 g/100g，As和Pb含量分別增加了0.13、0.49mg/kg，Hg未檢出。富集后的魚油過氧化值、碘值、As含量與富集前的魚油均存在顯著性差異，酸值、Pb含量有著極顯著性差異。富集后的魚油顏色、氣味優(yōu)于富集前的魚油。

3 結 論

本研究以精煉魚油為原料，通過單因素及響應面試驗得到脂肪酶水解富集EPA和DHA甘油酯的最佳工藝條件為：pH 8.0、反應溫度30 ℃、加酶量1.0%、反應時間4 h。在此條件下，EPA和DHA甘油酯總含量為21.65%，高于精煉魚油（12.35%），且富集后的魚油過氧化值、酸值、碘值、氣味及色澤均優(yōu)于精煉魚油。此研究工藝尚處于實驗室階段，放大實驗有待深入研究。該工藝及產(chǎn)品有利于低值魚類副產(chǎn)品的開發(fā)和利用。

參考文獻：

[1] KUMAR A R, SWAPNA H C, BHASKAR N, et al. Effect of fermentation ensilaging on recovery of oil from fresh water fish viscera[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2010, 46(1): 9-13.

[2] DISSARAPHONG S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. The influence of storage conditions of tuna viscera before fermentation on the chemical, physical and microbiological changes in fish sauce during fermentation[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(16): 2032-2040.

[3] KUMAR A R, BHASKAR N, BASKARAN V. Bioefficacy of EPADHA from lipids recovered from fish processing wastes through biotechnological approaches[J]. Food Chemistry, 2013, 136(1): 80-86.

[4] 馬永鈞, 楊博. 海洋魚油深加工技術研究進展[J]. 中國油脂, 2011, 36(4): 1-6.

[5] FABER J, BERKHOUT M, FIEDLER U, et al. Rapid EPA and DHA incorporation and reduced PGE2 levels after one week intervention with a medical food in cancer patients receiving radiotherapy, a randomized trial[J]. Clinical Nutrition, 2013, 32(3): 338-345.

[6] CHAPKIN R S, HONG M Y, FAN Y Y, et al. Dietary i-3 PUFA alter colonocyte mitochondrial membrane compsition and function[J]. Lipids, 2002, 37(2): 193-199.

[7] HEMANT P, SUNIL K P, LEIGH C W, et al. Effects of ALA, EPA and DHA in high-carbohydrate, high-fat diet-induced metabolic syndrome in rats[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2013, 24(6): 1041-1052.

[8] KAHVECI D, XU Xuebing. Repeated hydrolysis process is effective for enrichment of omega polyunsaturated fatty acids in salmon oil by Candida rugosa lipase[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4): 1552-1558.

[9] 曾遠平, 劉耘, 楊繼國. 魚油中EPA和DHA的富集方法及研究進展[J].現(xiàn)代食品科技, 2005, 22(1): 160-163.

[10] HAO Liuping, CAO Xuejun, HUR B K. Separation of single component of EPA and DHA from fish oil using silver ion modified molecular sieve 13X under supercritical condition[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2008, 14(5): 639-643.

[11] 吳可克. 酶促魚油選擇性水解制備EPA、DHA甘油酯的研究[J]. 中國油脂, 2002, 27(3): 91-93.

[12] 何鍵東, 王朋, 胡燁, 等. 魚油制備及EPA和DHA富集純化技術研究進展[J]. 農(nóng)業(yè)機械, 2011(20): 56-58.

[13] 劉書成, 章超樺, 謝燕, 等. 脂肪酶水解低值魚油富集EPA和DHA甘油酯的研究[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(3): 79-83.

[14] 國家糧食局西安油脂食品及飼料質量監(jiān)督檢驗測試中心, 北京市糧油食品檢驗所. GB/T 5530—2005 動植物油脂酸值和酸度測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2005.

[15] 武漢工業(yè)學院. GB/T 5532—2008 動植物油脂碘值的測定[S]. 北京:中國標準出版社, 2005.

[16] 國家糧食局西安油脂食品及飼料質量監(jiān)督檢驗測試中心. GB/T 5538—2005 動植物油脂過氧化值測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2005.

[17] HERWIG N, STEPHAN K, PANNE U, et al. Multi-element screening in milk and feed by SF-ICP-MS[J]. Food Chemistry, 2011, 124(3): 1223-1230.

[18] 國家水產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心, 福建高龍事業(yè)公司. SC/T 3502—2000 魚油[S]. 北京: 中國標準出版社, 2005.

[19] 鄭毅, 鄭楠, 吳松剛. 固定化脂肪酶選擇性富集魚油ω-3多不飽和脂肪酸甘油酯[J]. 化工學報, 2006, 57(2): 353-358.

Lipase-Catalyzed Enrichment of EPA and DHA Glycerides from Visceral Oil of Small Yellow Croaker

LIU Guo-ya n, ZHANG Tian-tian, WANG Jin-xing, SUN Bei-bei, BIAN Hao, XU Xin*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Objective: The refined fish oil extracted from gut organs of small yellow croakers was hydrolyzed by lipase to enrich eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) glycerides. Methods: Gas chromatography (GC) combined with peak area external standard method was used to determine the contents of EPA and DHA glycerides. Onefactor-at-a-time method followed by response surface analysis was used to analyze the effects of pH, temperature, enzyme amount and hydrolysis time on enrichment efficiency. Results: The optimal conditions for enriching EPA and DHA glycerides were found to be hydrolysis at 30 ℃ for 4 h with an enzyme dosage of 1.0% under neutral pH condition. Under these conditions, the total amount of EPA and DHA glycerides was 21.65%, which was influenced in increasing order by hydrolysis time, pH, temperature and enzyme dosage. Conclusion: The physical and chemical indexes and sensory evaluation of EPA and DPA-enriched fish oil were better than those of fish oil before enrichment with a 1.74-fold increase in the total of EPA and DHA glycerides. As a result, the natural EPA and DHA glycerides were obtained.

lipase; small yellow croaker viscera; refined fish oil; EPA glyceride; DHA glyceride

TS222.1

A

1002-6630（2014）24-0091-05

10.7506/spkx1002-6630-201424017

2014-07-06

劉國艷（1979—），女，講師，博士研究生，研究方向為油脂營養(yǎng)與安全。E-mail：liugy@yzu.edu.cn

*通信作者：徐鑫（1977—），男，副教授，博士，研究方向為功能食品。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn