陳 蘋 邱成功 鄒 秀 周健愷 徐善良 王春琳王丹麗① 趙云龍

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211;2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200062)

蚤狀溞(Daphnia pulex)為一種常見(jiàn)的小型浮游動(dòng)物,屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、鰓足亞綱(Branchiopoda)、枝角亞目(Cladocera)。枝角類營(yíng)養(yǎng)豐富,易培養(yǎng),繁殖周期短且繁殖量大,是許多水生動(dòng)物的優(yōu)良天然活餌料。枝角類有兩種生殖方式,即孤雌生殖(parthenogenesis)和兩性生殖(sexual reproduction)。外界條件適宜時(shí)枝角類行孤雌生殖(無(wú)性生殖),當(dāng)外界環(huán)境條件惡化時(shí)行兩性生殖(有性生殖)。孤雌生殖有助于其種群的迅速發(fā)展,而兩性生殖形成的休眠卵(冬卵)能確保其渡過(guò)惡劣環(huán)境,以維持種群的存在與延續(xù),但種群數(shù)量會(huì)在短期內(nèi)迅速下降(Jianget al,1979)。蚤狀溞等枝角類能靈敏準(zhǔn)確的判斷外界環(huán)境的優(yōu)良,選擇適應(yīng)的生殖狀態(tài),從而避免種群滅絕的危機(jī)。

熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)是一類在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守并廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白。它是機(jī)體在應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì),由 Ritassa(1964)在 1962年首次從果蠅中發(fā)現(xiàn)。到了 1974年,Tisseres等(1974)發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)中可以轉(zhuǎn)錄合成一組特殊蛋白,而且伴隨著這類蛋白的合成,細(xì)胞的其它蛋白合成卻受到抑制,而且昆蟲(chóng)體內(nèi)熱激蛋白的表達(dá)量越高,其耐熱性就越強(qiáng)(Leet al,2001;Murphyet al,2003)。除了高熱之外,多種應(yīng)激原如重金屬、饑餓、缺氧、缺血等都可以誘導(dǎo)Hsp的表達(dá)。根據(jù)分子重量和同源程度,熱休克蛋白分為 Hsp90s(83—99kDa)、Hsp70s(68—80kDa)、Hsp60s,以及小 Hsp(25—28kDa)(Lindquistet al,1988),其中Hsp90家族是較為重要的一族,目前研究較多(徐明波等,1991)。Hsp90是一種ATP依賴的伴侶蛋白,是真核生物中含量最豐富的胞質(zhì)蛋白。Hsp90廣泛參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素應(yīng)答及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程,對(duì)細(xì)胞在生理、病理及應(yīng)激條件下的生存發(fā)揮了重要作用。在細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),Hsp90可以和那些由于環(huán)境刺激而使自身構(gòu)象發(fā)生改變的蛋白相互作用,保證蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B并防止蛋白非特異性聚集,所以Hsp90有可能通過(guò)環(huán)境的改變參與了枝角類的生殖轉(zhuǎn)化調(diào)控。羅文等(2012)也推測(cè)到一些化學(xué)感應(yīng)基因(CSP)和熱激蛋白(HSP)基因在枝角類孤雌生殖中起到非常重要的作用。目前已經(jīng)有多種甲殼綱動(dòng)物包括蝦(Wuet al,2008)、龍蝦(Changet al,1999;Speeset al,2002;Chang,2005)、水蚤(Bondet al,1993;Kotovet al,2006;Soetaertet al,2006)、陸生十足類(Gusevet al,2006)對(duì)Hsp90基因進(jìn)行研究,而且有研究報(bào)道表明 Hsp90參與甲殼綱的生理發(fā)育調(diào)解,如對(duì)刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)Hsp90的研究顯示Hsp90能調(diào)解雌性激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而調(diào)解卵黃蛋白原的合成(Wuet al,2008)。對(duì)美洲海螯蝦(Homarus americanus)進(jìn)行滲透脅迫研究,發(fā)現(xiàn)Hsp90 mRNA在腹部肌肉中的表達(dá)水平顯著增加(Speeset al,2002);對(duì)大型溞(Daphnia magna)的研究顯示Hsp90是幼體發(fā)育的上調(diào)基因,在大型溞的發(fā)育中起到積極作用(Soetaertet al,2006)。但是人們對(duì)于蚤狀溞Hsp90基因知之甚少。本研究以蚤狀溞為研究對(duì)象,采用同源克隆和RACE-PCR的方法,克隆了蚤狀溞Hsp90的cDNA全長(zhǎng),利用Real-Time PCR技術(shù)分析了Hsp90 mRNA在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的表達(dá)水平,旨在探索枝角類生殖轉(zhuǎn)化的規(guī)律和分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蚤狀溞由本實(shí)驗(yàn)室單克隆培養(yǎng)獲得,體長(zhǎng)(3.2±0.8)mm。挑選健康活力強(qiáng)的個(gè)體暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室玻璃培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)溫度(25±1)°C,光周期為 14h光照和10h黑暗。培養(yǎng)于“Banta糞土培養(yǎng)液”(1.5g兔子糞 + 2g干稻草 + 10g土壤 + 950mL自來(lái)水經(jīng)煮沸后取上清液),并交叉投喂小球藻等單細(xì)胞藻類,每天投喂餌料1次。雄溞的獲得:培養(yǎng)兩周后,當(dāng)溞密度達(dá)到3000只/L以上時(shí),缸內(nèi)溞的生殖方式逐漸轉(zhuǎn)為有性生殖,雄溞出現(xiàn)。

提取總RNA的試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit)為TaKaRa公司;Realtime-PCR采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTMHot Start Version試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄酶及其它主要試劑為 TaKaRa公司產(chǎn)品。3′RACE、5′RACE PCR 擴(kuò)增使用 Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒。PCR的擴(kuò)增引物由上海桑尼生物公司合成,PCR產(chǎn)物由上海Invitrogen生物公司克隆測(cè)序。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從 GenBank中獲得已注冊(cè)的迷糊酢蚤(Daphnia ambigua,ABI35828.1)、山形水蚤(Daphniasp.Yamagata,ABI35815.1)、光滑水蚤(Daphnia laevis,ABI35823.1)和紋水蚤(Daphnia dubia,ABI35824.1)基因,根據(jù)此序列,運(yùn)用Vector NTI 11.0軟件找到Hsp90基因的保守區(qū)域,在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)出蚤狀溞Hsp90基因的兼并引物 Hsp90-F/R,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,獲得一條長(zhǎng)約250bp核心的片段,再根據(jù)此部分片段設(shè)計(jì) 5′RACE和 3′RACE 特異性引物 HSP-5’RACE 和 HSP-3′RACE擴(kuò)增出DpHsp90全長(zhǎng)cDNA序列,進(jìn)一步設(shè)計(jì)出實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Hsp90-YF和Hsp90-YR?；谠闋顪袃?nèi)參基因18S(AF014011.1)的cDNA序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因序列引物18S-F和18S-R,用1對(duì)內(nèi)參基因引物18S-F/R 和1對(duì)特異性引物Hsp90-YF/YR來(lái)檢測(cè)蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下Hsp90 mRNA的表達(dá)情況(引物見(jiàn)表1)。

表1 試驗(yàn)中用到的引物名稱及序列Tab.1 Oligonucleotide primers used in the experiments

1.3 蚤狀溞總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用 RNA提取試劑盒(RNA Extraction Kit,Axygen)分別提取孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit)進(jìn)行上述 RNA 反轉(zhuǎn)錄以得到 cDNA。37°C 反轉(zhuǎn)錄15min,85°C 5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶。合成的cDNA產(chǎn)物于–20°C保存或直接用于PCR。

1.4 Hsp90基因cDNA片段的克隆

以蚤狀溞兩性溞(帶冬卵)cDNA為模板,采用兼并引物HSP-F和HSP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為50μL,優(yōu)化后擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s,53°C退火30s,72°C延伸1min,35個(gè)循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),送上海Invitrogen生物公司克隆測(cè)序。

1.5 Hsp90基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得

測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行 BlastX分析比對(duì),以上實(shí)驗(yàn)所得Hsp90部分序列與其它物種的Hsp90同源,則根據(jù)測(cè)得的序列再設(shè)計(jì) 5′RACE 和 3′RACE 特異性引物HSP-5′RACE 和 HSP-3′RACE 用于 RACE 擴(kuò)增。采用SMARTTMRACE cDNA 試劑盒(Clontech)進(jìn)行 5′RACE和3′ RACE獲得全長(zhǎng)cDNA。

1.6 生物信息學(xué)分析

用 Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行蛋白理化特性預(yù)測(cè),核酸和蛋白序列相似性比較利用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上的BlastX工具進(jìn)行比對(duì)分析;通過(guò)NCBI的ORF Finder進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析并預(yù)測(cè)氨基酸序列;SignalP程序分析信號(hào)肽;采用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。用MEGA5.1軟件中的N-Jn(eighborjoining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。用自展法(Bootstrap)進(jìn)行 1000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置3個(gè)10L玻璃鋼,每只缸接種密度50只/L孤雌溞,進(jìn)行充氣培養(yǎng),其它培養(yǎng)條件一樣。當(dāng)培養(yǎng)密度達(dá)到3000只/L以上時(shí)進(jìn)行采樣,從每只缸分別采孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵5種樣本,每種樣本3個(gè)平行組。

首先優(yōu)化模板濃度,將各類模板稀釋成10、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7μmol/L 八個(gè)濃度梯度,分別用引物進(jìn)行擴(kuò)增,以確定最佳模板濃度。另外對(duì)引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性30s;95°C變性5s,57°C退火30s,72°C 30s,40個(gè)循環(huán)。每種生殖狀態(tài)的樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后確定Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,數(shù)據(jù)采集和處理在ABI StepOnePlusTMInstrument上進(jìn)行。

每種生殖狀態(tài)下溞的樣品進(jìn)行3次重復(fù)。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值(Mean,M)±標(biāo)準(zhǔn)差(Stdeva,SD)表示,所測(cè)數(shù)據(jù)以SPSS 14.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用One-Way ANOVA 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),并用 Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Livak等(2001)的方法進(jìn)行引物的效率檢測(cè),PCR產(chǎn)物的溶解曲線沒(méi)有雜峰,顯示產(chǎn)物特異性好。采用 2-△△Ct法分析處理qRT-PCR結(jié)果,ΔCt定義為內(nèi)標(biāo)18S Ct值與目的基因(Hsp90)Ct值的差值,以孤雌幼溞對(duì)照組的表達(dá)量為1。

2 結(jié)果

2.1 蚤狀溞Hsp90基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

以蚤狀溞 cDNA全長(zhǎng)為模版,用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一條250bp片段,經(jīng)Blast X分析,顯示與已登錄的迷糊酢蚤D.ambigua(ABI35828.1)、山形水蚤D.sp.Yamagata(ABI35815.1)、光滑水蚤D.laevis(ABI35823.1)和紋水蚤D.dubia(ABI35824.1)Hsp90基因的同源性都達(dá)到了97%以上,表明該片段是Hsp90基因的一部分。以這段序列設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE 引物分別進(jìn)行 5′-RACE 和 3′-RACE,測(cè)序后所得序列通過(guò)比對(duì)拼接得到了一條 2568bp的全長(zhǎng)蚤狀溞Hsp90序列(GenBank登錄號(hào):KC845247)(圖1)。為驗(yàn)證序列的可靠性,重新設(shè)計(jì) HSP-CDS-F、HSP CDS-R克隆Dptra全長(zhǎng)序列,結(jié)果與拼接結(jié)果一致,證明完整 cDNA克隆成功。將該溞Hsp90基因的全長(zhǎng)cDNA序列命名為Daphnia pulexHsp90(DpHsp90)。

2.2 蚤狀溞DpHsp90蛋白序列特征分析

蚤狀溞 Hsp90全長(zhǎng)核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖1所示,cDNA全長(zhǎng)為2568bp,包含了一個(gè) 164bp的 5′-UTR 區(qū)域和一個(gè) 249bp的 3′-UTR(非編碼區(qū))區(qū)域,其中包括一個(gè)終止密碼子(TGA)、多聚腺苷酸信號(hào)序列(ATTAAA)和polyA尾。2155bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼了718個(gè)氨基酸,含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site)和N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site)。結(jié)構(gòu)域分析顯示HSP90在編碼區(qū)存在 5個(gè)該蛋白家族的特有的保守信號(hào)區(qū):NKEIFLRELISNSSDALDKIR(34—54aa):LGTIAKSGT(101—109aa);IGQFGVGFYSPYLVTD(125—140aa);IKLYVRRVF(346—354aa);GVVDSEDLP LNISRE(372—386 aa);一個(gè)GxxGxG序列,一個(gè)LxxLL模塊,同時(shí)在HSP90羧基末端存在一個(gè)保守的MEEVD序列(714—718 aa),這與已知的所有昆蟲(chóng)HSP90基因結(jié)構(gòu)一致(Peteret al,1998),與細(xì)胞質(zhì)HSP90羧基末端的保守基序相同。

圖1 蚤狀溞Hsp90基因的cDNA全長(zhǎng)及推斷氨基酸Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of D.pulex Hsp90 cDNA

2.3 蚤狀溞Hsp90結(jié)構(gòu)分析

DNAMAN預(yù)測(cè)的 Hsp90蛋白的等電點(diǎn)是 5.01,相對(duì)分子質(zhì)量為 82552.61。Hsp90蛋白含有一個(gè)HATPase_c結(jié)構(gòu)域(殘基36—149位)、一個(gè)Hsp90蛋白結(jié)構(gòu)域(殘基190—718位)和一個(gè)Mg2+結(jié)合位點(diǎn)(殘基45位-天冬酰胺)(圖2)。

圖2 蚤狀溞Hsp90蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.2 Hsp90 protein structure domain of D.pulex

2.4 蚤狀溞Hsp90氨基酸序列同源性分析

利用ClustalW對(duì)蚤狀溞Hsp90和NCBI中其它甲殼綱動(dòng)物(共14種)Hsp90的多序列比對(duì)見(jiàn)圖3。分析表明:這些比對(duì)的序列之間的同源性較高。蚤狀溞Hsp90與日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)和刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)的同源性最高為 85%,與其它 11個(gè)種類:中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、矮小擬鏢劍水蚤(Paracyclopina nana)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、真寬水蚤(Eurytemora affinis)、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)、劍水蚤(Tigriopus japonicus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)、紅螯相手蟹(Chiromantes haematocheir)的同源性都在79%以上。

利用MEGA5.1軟件對(duì)NCBI中部分節(jié)肢動(dòng)物的Hsp90基因序列進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析,在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的基礎(chǔ)上研究了蚤狀溞和其它種類 Hsp90蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系(見(jiàn)圖4)。從進(jìn)化樹(shù)中,可以看出蚤狀溞Hsp90首先與劍水蚤(T.japonicus)、日本沼蝦(M.nipponense)、紅螯相手蟹(C.haematocheir)、擬穴青蟹(S.paramamosain)、中華絨螯蟹(E.sinensis)等甲殼綱聚為一類,然后再與蛛形綱的肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、龍骨三色蝎(Opistophthalmus carinatus)聚為一亞群。昆蟲(chóng)綱的印度跳蟻(Harpegnathos saltator)、刺柚釉小蜂(Quadrastichus erythrinae)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)、白背飛虱(Sogatella furcifera)、中華稻蝗(Oxya chinensis)、豆莢草盲蝽(Lygus hesperus)等聚為另一亞群。

2.5 Hsp90 mRNA在蚤狀溞各生殖狀態(tài)下的表達(dá)差異

Hsp90基因在孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵(冬卵)中的表達(dá)差異如圖5所示。從圖5中可以看出:Hsp90 mRNA在雄溞體中表達(dá)量最高,其次為兩性溞(帶冬卵),孤雌溞(帶夏卵)次之,在休眠卵中的表達(dá)量最低。Hsp90 mRNA在兩性溞(帶冬卵)和雄溞中的表達(dá)量顯著高于孤雌溞(帶夏卵)和孤雌幼溞(P<0.05)。

3 討論

Hsp90蛋白家族是一類在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守并廣泛存在的分子伴侶,在非應(yīng)激和正常生理狀態(tài)下占細(xì)胞蛋白總量的1%—2%,其具體功能尚未明確,它能夠識(shí)別并調(diào)節(jié)胞內(nèi)基質(zhì)的活性并在環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)揮功能。為進(jìn)一步了解HSP90基因特點(diǎn),本文獲得蚤狀溞HSP90 cDNA的完整序列,2155bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼了 718個(gè)氨基酸,在蚤狀溞基因組中定位于 scaffold_173:115844—118680(GenBank accession:GL732695.1),編碼718 氨基酸。通過(guò)氨基酸序列比對(duì),作者發(fā)現(xiàn)蚤狀溞Hsp90與已知的甲殼綱具有共同的序列特征,包含HSP90家族的5個(gè)特征信號(hào)序列(NKEIFLRELISNSSDALDKIR、IGQFGVGFYSAFLVAD、LGTIAKSGT、IKLYVRRVFI和 GVVDSEDLP LNISRE)(見(jiàn)圖1),有研究表明,植物、動(dòng)物和真菌的HSP90家族中均存在這5條特征序列(Gupta,1995),大多數(shù)生物的這5條特征序列幾乎完全相同(Farcyet al,2007;Liet al,2009),僅有少數(shù)生物存在個(gè)別氨基酸差異(Bruntet al,2004)。這些信號(hào)特征可被 HOP(HSP70 and HSP90 organizing protein)的 TPR(Tetra-tricopeptide repeat)區(qū)段識(shí)別,進(jìn)而與熱休克蛋白 70構(gòu)成分子伴侶復(fù)合體(Chenet al,2005)。在同源性比對(duì)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn) GxxGxG、LxxLL模塊。GxxGxG模塊是Hsp90與ATP結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Prodromouet al,1997),它的存在對(duì)Hsp90功能的正常發(fā)揮具有重要作用;LxxLL模塊在Hsp90功能調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮著重要的作用(Michaelet al,2005);其C末端的MEEVD序列說(shuō)明此Hsp90存在于細(xì)胞質(zhì)中,為胞質(zhì)蛋白(Pelham,1989;Gupta,1995)。這些功能結(jié)構(gòu)都存在于保守區(qū)(圖3),與翟會(huì)芳等(2010)報(bào)道的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、張道偉等(2012)報(bào)道的白背飛虱(Sogatella furcifera)的Hsp90的功能保守結(jié)構(gòu)一致。結(jié)構(gòu)分析說(shuō)明蚤狀溞Hsp90與其它物種Hsp90基因具有相似的功能。另外根據(jù)是否含有豐富的谷氨酰胺片段,Hsp90可分為Hsp90α和 Hsp90β(Hickeyet al,1989)。蚤狀溞HSP90不含有 Hsp90α所特有的磷酸化位點(diǎn)序列TQTQDQ(Picard,2002),因此可以判定本文克隆的是Hsp90β基因。

圖3 蚤狀溞Hsp90與其它物種氨基酸序列比對(duì)Fig.3 The predicted amino acid sequence of Hsp90 of D.pulex was compared with Hsp90 of other species

圖4 Hsp90基因的進(jìn)化樹(shù)分析圖Fig.4 Phylogenetic tree connecting the Hsp90 genes

圖5 Hsp90 mRNA在不同生殖狀態(tài)下的表達(dá)水平Fig.5 The level of Hsp90 mRNA transcription of different reproductive modes

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,作者發(fā)現(xiàn)節(jié)肢動(dòng)物Hsp90明顯分為兩大類群,甲殼綱和蛛形綱聚為一亞群,昆蟲(chóng)綱聚為另一亞群,說(shuō)明節(jié)肢動(dòng)物甲殼綱和蛛形綱的親緣關(guān)系比較近。蚤狀溞Hsp90與劍水蚤、日本沼蝦、紅螯相手蟹等甲殼綱的親緣關(guān)系最近;其次與蛛形綱的肩突硬蜱、龍骨三色蝎相關(guān)聯(lián);與印度跳蟻、刺柚釉小蜂、褐飛虱等昆蟲(chóng)綱動(dòng)物在分子進(jìn)化上距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

為了驗(yàn)證 Hsp90與枝角類的生殖轉(zhuǎn)化是否有相關(guān)性,本論文用Real Time PCR的方法檢測(cè)了Hsp90 mRNA在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的表達(dá)水平。結(jié)果顯示 Hsp90在孤雌幼溞和孤雌溞中的表達(dá)量并無(wú)顯著性差異,這一結(jié)果說(shuō)明 Hsp90的表達(dá)與性成熟不相關(guān)。Hsp90 mRNA在雄溞中的表達(dá)量最高,其次是兩性溞(帶冬卵),且在冬卵中的表達(dá)量最低。在相同環(huán)境條件下Hsp90 mRNA在雄溞和兩性溞(帶冬卵)中的表達(dá)量明顯高于孤雌溞(帶夏卵),這說(shuō)明Hsp90可能與兩性溞(帶冬卵)和雄溞的形成有關(guān),兩性溞(帶冬卵)和雄溞是在高密度等環(huán)境惡化的的條件下產(chǎn)生的,高密度的應(yīng)激條件誘導(dǎo)了Hsp90的表達(dá),保護(hù)兩性溞和雄溞在環(huán)境脅迫條件下的發(fā)育生長(zhǎng),從而也提高雄溞和兩性溞(帶冬卵)抵抗環(huán)境中由高密度引起的低溶氧、低pH和食物稀少的能力。關(guān)于大型溞Hsp90也有研究報(bào)道,在環(huán)境壓力條件下,Hsp90在胚胎發(fā)育過(guò)程中起到積極作用,Hsp90在環(huán)境壓力條件下有保護(hù)胚胎細(xì)胞的作用(Sasset al,1997;Federet al,1999;Lewiset al,1999;Soetaertet al,2006)。Hsp90在蚤狀溞冬卵中的表達(dá)量最低,可能是因?yàn)槎烟幱谛菝郀顟B(tài)中,新陳代謝非常緩慢(幾乎停滯),故mRNA的表達(dá)水平也低于其它四種生殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),Hsp90 mRNA在兩性溞和雄溞中的表達(dá)也有顯著差異(P<0.05),在雄溞中的表達(dá)量明顯高于兩性溞,這說(shuō)明Hsp90可能參與了精子的形成過(guò)程。王楓(1997)也報(bào)道了Hsp90在草魚(yú)的睪丸和腦中表達(dá)量最高。同樣Huang等(1999)報(bào)道,在精子冷凍的過(guò)程中,Hsp90的含量急劇下降,從而導(dǎo)致了精子活力下降;另外Huang等(2000)也發(fā)現(xiàn),把GA(一種Hsp90蛋白的特異性抑制劑)加入到精子稀釋液中,會(huì)導(dǎo)致精子活力下降。張瑩(2011)也發(fā)現(xiàn)Hsp90與精子活力、頂體完整率和精子畸形率均有一定相關(guān)性。Fatima(2013)明確提出Hsp90能為精子的形成過(guò)程提供動(dòng)力。以上研究表明 Hsp90基因有可能在調(diào)控生殖轉(zhuǎn)化上發(fā)揮作用。至于Hsp90基因在蚤狀溞中的具體作用及其作用機(jī)理等問(wèn)題,作者將會(huì)通過(guò) RNA干擾、相關(guān)功能基因過(guò)量表達(dá)以及免疫組化技術(shù)等,進(jìn)行更深入的研究。

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